将人的皮肤成纤维细胞直接诱导为神经干细胞

贾伟丽，李 默，吴剑宇，王淑艳，陈志国，张 愚*

(首都医科大学宣武医院 1.细胞生物室； 2.教育部神经变性病重点实验室， 北京 100053)

研究论文

将人的皮肤成纤维细胞直接诱导为神经干细胞

贾伟丽1,2，李 默1,2，吴剑宇1,2，王淑艳1,2，陈志国1,2，张 愚1,2*

(首都医科大学宣武医院 1.细胞生物室； 2.教育部神经变性病重点实验室， 北京 100053)

目的探讨将人的皮肤成纤维细胞诱导为神经干细胞。方法将成人的皮肤成纤维细胞用带有Pax6报告基因和绿色荧光蛋白的慢病毒感染，并经历其病毒载体的抗性基因嘌呤霉素筛选后的细胞作为初始细胞，转入在维持神经干细胞生长发育、分化、保持功能稳定性和可塑性中起非常重要作用的10个基因Sox2、Klf4、c-Myc、Tcf3、Ascl1、Brn2、Neurog2、Foxg1、Hes1和Id1，对经过重新编程表达GFP绿色荧光蛋白的细胞用流式细胞仪进行筛选，并对其进行免疫荧光染色和分化的鉴定。结果转入基因后成功诱导为神经干细胞(iNSCs)。iNSCs能表达神经干细胞的标志性基因(Nestin)，能分化为神经元(β Ⅲ-tubulin)和星形胶质细胞(GFAP)。结论通过转入外源因子的方式可以将人的皮肤成纤维细胞诱导为神经干细胞。

诱导神经干细胞；人的皮肤成纤维细胞；重编程；转录因子；报告基因

神经干细胞(neural stem cells,NSCs)是存在于胚胎或成体脑组织中的一种干细胞，可以自我更新，并分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞。

人源神经干细胞 (human neural stem cells,hNSCs)主要来源于流产胎儿的脑组织，除来源不稳定和供给受限制外，还面临着将非自体的细胞进行移植所引发的免疫排斥反应。诱导多功能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)[1]和诱导神经元(induced neurons,iNs)[2-6]的出现可以解决免疫排斥问题，但iPSCs分化后残留细胞的致瘤性，iNs无法在移植后存活都限制了其的临床应用。本实验运用转入外源因子的方式将人的皮肤成纤维细胞诱导为诱导神经干细胞(induced neural stem cells,iNSCs)，并对其进行了NSCs的相关鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

皮肤成纤维细胞(fibroblast)系GM00498(Coriell公司)，fibroblast的培养成分如下：高糖DMEM，15%胎牛血清，L-谷氨酸，青链霉素，非必须氨基酸。293T细胞的培养成分如下：高糖DMEM，10%胎牛血清，L-谷氨酸，青链霉素。NSCs培养成分如下：DMEM F12+N2+B27+胰岛素+牛血清白蛋白+20 ng/mL bFGF(基本成纤维细胞生长因子)(Ramp;D公司)+20 ng/mL EGF(表皮生长因子)(Ramp;D公司)+20 ng/mL PDGFAB(细胞分裂因子)(Ramp;D公司)。NSCs分化培养成分：DMEM F12+N2+B27+胰岛素+牛血清白蛋白。免疫荧光染色磷酸缓冲液成分：0.01 mol/L PBS+0.3% Triton X-100。抗体稀释液成分： 1%驴血清+磷酸缓冲液。培养皿培养板(Falcon公司)，RNA提取试剂盒(Qiagen公司)，反反转录试剂盒(Promega公司)，DNA聚合酶(Takala公司)，EcoR1、T4连接酶(Biolabs公司)，Nestin、Olig2、Ki67、GFAP、β Ⅲ-tubulin(Millipore Bioscience公司)，BrdU(AbD Serotec公司)，DAPI(Sigma公司)，荧光二抗(Jackson公司)，超滤管(Beckman公司)，载体Tet-O-FUW-EGFP(Addgene公司)，细胞培养试剂除以上注明外(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 Fibroblast的培养和传代： fibroblast接种于10 cm培养皿中，用fibroblast培养基培养，隔天换液。

1.2.2 带报告基因的初始细胞的获得: 用带有Pax6报告基因和GFP的慢病毒去感染fibroblast,病毒是通过293T病毒包装细胞产生，超滤管6 000×g超速离心1 h获得，加聚凝胺(4 g/L)增加转染效率，24 h后换fibroblast培养基，24 h后加入嘌呤霉素(50 μg/mL)筛选5 d。将其用0.25%胰蛋白酶消化成单细胞，按照20 000/mL浓度接种于6孔板中。

1.2.3 iNSCs的诱导:从hNSCs提取RNA,以反转录得到的cDNA作为模板，用预先设计的引物序列(表1)PCR得到目的片段。利用EcoR1内切酶将Tet-ON-FUW-EGFP和目的片段双酶切， T4连接酶连接，得到目的质粒Tet-O-FUW-Sox2，Tet-O-FUW-Klf4，Tet-O-FUW-c-Myc，Tet-O-FUW-Tcf3，Tet-O-FUW-Ascl1，Tet-O-FUW-Brn2，Tet-O-FUW-Neurog2，Tet-O-FUW-Foxg1，Tet-O-FUW-Hes1，Tet-O-FUW-Id1。通过293T病毒包装细胞产生病毒，超滤管6 000×g超速离心1 h获得浓缩病毒。利用293T细胞进行滴度测定，并将慢病毒分别感染293T细胞，进行RT-PCR检测，保证病毒工作。

表1 引物的序列Table 1 The sequence of primers

在fibroblast培养基中，加入以上10种慢病毒，聚凝胺(4 g/L)，按照MOI=10感染fibroblast，恢复24 h后换成fibroblast培养基，24 h后重新第2轮感染，24 h后换成fibroblast培养基，恢复24 h，之后使用NSCs培养基培养。

1.2.4 iNSCs的初步筛选：在病毒感染后14 d荧光显微镜下确认绿色细胞后，用accutase细胞消化液对其进行消化制作单细胞悬液，进行流式细胞仪分选，阳性细胞继续用NSCs培养基培养。

1.2.5 iNSCs的鉴定和分化鉴定：分选的阳性细胞一部分进行悬浮增殖的培养；一部分接种到24孔板中铺有多聚赖氨酸+层黏连蛋白的玻璃片上。将玻璃片上的细胞一部分进行神经干细胞特异性标志物和细胞增殖能力的鉴定；另一部分撤掉生长因子，用NSCs分化培养基使其向神经元、星形胶质细胞方向分化。14 d后进行神经元、星形胶质细胞特异性标志物的鉴定。

1.2.6 免疫荧光细胞染色：细胞4%多聚甲醛(PFA)固定10 min，磷酸缓冲液洗3次，3%驴血清封闭1 h。稀释浓度为：一抗1∶500，二抗1∶200。

iNSCs特异性标志物的鉴定，采用一抗为小鼠抗人的Nestin，兔抗人的Olig2，荧光二抗分别为驴抗小鼠Fitc，驴抗兔Fitc。

iNSCs增殖能力的鉴定，采用的一抗为兔抗人的Ki67，大鼠抗人的BrdU，荧光二抗对应分别为驴抗兔Cy-3，驴抗大鼠Cy-3。

iNSCs的分化鉴定，采用的一抗为兔抗人的GFAP和小鼠抗人的β Ⅲ-tubulin，荧光二抗分别用驴抗兔Cy-3，驴抗小鼠Fitc。

以上均于加一抗后4 ℃过夜，磷酸缓冲液洗3次，间隔5 min，加荧光二抗避光孵育2 h，磷酸缓冲液洗3次，间隔5 min， DAPI(1∶200)核染色，磷酸缓冲液洗3次，间隔5 min，封片剂封片，共聚焦显微镜观察拍摄。

2 结果

2.1 神经干细胞聚集体的获得

经病毒诱导，荧光显微镜下确认有绿色荧光蛋白表达后，流式细胞仪进行筛选，形成悬浮的类似神经干细胞的聚集体(图1)。

A.images of fibroblast before infection； B.iNSCs in suspension cultures图1 转录因子可诱导皮肤成纤维细胞为类似神经干细胞的细胞Fig 1 Fibroblast could be induced to cells similar to NSCs by transcription factors(×100)

2.2 Pax6报告基因的应用

Pax6为神经干细胞的标志性基因，通过GFP的表达为流式细胞仪分选创造了条件，以此可以得到相对较纯的iNSCs。

A.Nestin; B.Olig2; C.Ki67; D.BrdU图2 神经干细胞和增殖能力的鉴定Fig 2 The characterization and proliferation identification of NSCs

2.3神经干细胞增殖和分化的免疫荧光鉴定

将iNSCs进行NSCs特异性标志物的染色鉴定，免疫荧光染色显示Nestin、Olig2均为阳性(图2A，B)；其增殖能力的标志物鉴定，免疫荧光染色显示Ki67、BrdU均为阳性(图2C，D)。定向分化的iNSCs进行神经元、星形胶质细胞特异性标志物的染色鉴定，免疫荧光结果显示神经元特异性标志物β Ⅲ-tubulin，星形胶质细胞特异性标志物GFAP均为阳性(图3)。

A.β Ⅲ-tubulin; B.GFAP图3 神经干细胞定向分化能力鉴定Fig 3 The directional differentiation potency identification of NSCs

免疫荧光染色证明诱导得到的细胞为具有自我增殖能力和向神经元、星形胶质细胞分化的类似于NSCs的细胞。

3 讨论

由于神经细胞属于不可再生细胞，所以很多神经系统疾病的恢复治疗面临很大的难题。比如帕金森病是黑质致密区多巴胺能神经元变性死亡；多发性硬化主要为胶质细胞受到损伤。而神经干细胞、神经细胞的移植为神经系统疾病治疗带来了新的希望。出于伦理学和降低异体排斥引发的各类并发症的考虑，自体神经组织或细胞是最理想的移植来源，但iPSCs[1]分化后残留细胞的致瘤性，iNs[2-6]无法在移植后存活都限制了其的临床应用。因此，将成体细胞直接诱导为NSCs为细胞治疗的临床应用提供了一个更为安全有效的选择。小鼠诱导神经干细胞(mouse induced neural stem cells, miNSCs)[7]本实验室已成功获得，而hiNSCs，都是利用诱导iPSCs的方法通过改变培养环境或者条件获得[8-9]，其是否经历了多功能干细胞的阶段尚未清楚，其致瘤性的危险成为临床治疗的阻碍。本实验应用转入转录因子的方式，通过外源因子激活相应的内源因子表达，从而使细胞重新编程，得到类似于NSCs的细胞，是非常具有临床研究前景的。

本实验对iNSCs进行了NSCs特异性标志物的检测和增殖分化的检测，同时也对其与流产胎儿取材来源的hNSCs进行了对比，本实验得到的iNSCs聚集体是一个细胞杂合体，不单纯都是具有增殖能力的iNSCs，其少量分化为神经元和星形胶质细胞，未能分化为少突胶质细胞。另外其的增殖能力较差，不能进行多代次的传代培养，相比于取材来源的hNSCs还有一定的差别。

总之，将成体细胞直接诱导为iNSCs是神经系统疾病细胞治疗的研究热点，本实验有待于继续提升的是诱导iNSCs的效率，和对iNSCs纯度的筛选来保证iNSCs的增殖能力。

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Generation of induced neural stem/progenitor cells from human fibroblasts

JIA Wei-li1,2, LI Mo1,2, WU Jian-yu1,2, WANG Shu-yan1,2, CHEN Zhi-guo1,2, ZHANG Yu1,2*

(1.Dept. of Cell Biology；2.Key Laboratory of Neurodegeneration, Ministry of Education,Beijing Institute of Geriatrics, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, Beijing 100053, China)

ObjectiveTo induce neural stem/progenitor cells (iNSCs) from human fibroblasts.MethodsHuman fibroblasts were infected with lenti-virus expressing green fluorescent protein (GFP) under Pax6 promoter, followed by a puromycin-resistant gene. Puromycin-selected fibroblasts were used as starter cells and infected with virus encoding 10 transcription factorsSox2,Klf4,c-Myc,Tcf3,Ascl1,Brn2,Neurog2,Foxg1,Hes1,Id1, which play critical roles in the development, differentiation, functional stability and plasticity of neural cells. The reprogrammed cells were GFP-positive and were sorted by using flow cytometer and characterized by fluorescence staining and differentiation assay.ResultsiNSC expressed NSC markers (Nestin) and may differentiate into neurons(β Ⅲ-tubulin) and astrocytes(GFAP).ConclusionsHuman fibroblasts can be converted to NSC-likes cells by 10 transcription factors.

induced neural stem/progenitor cells; human fibroblast; reprogramming; transcription factors; pax6 reporter gene

2013-12-26

2014-01-08

国家自然科学基金(31340075, 31070946)； 国家重点基础研究发展计划(973)(2012CBA01307)

*通信作者(correspondingauthor)： yaz@bjsap.org

1001-6325(2014)05-0579-04

Q 28

A