生物有机肥对烤烟黑胫病及根际微生物代谢功能多样性的影响

张云伟，徐智，汤利，李艳红，宋建群，殷红慧

1云南农业大学资源与环境学院，昆明 650201；

2云南省文山州烟草公司，文山 663000

生物有机肥对烤烟黑胫病及根际微生物代谢功能多样性的影响

张云伟1，徐智1，汤利1，李艳红1，宋建群1，殷红慧2

1云南农业大学资源与环境学院，昆明 650201；

2云南省文山州烟草公司，文山 663000

通过田间小区试验，比较了施肥处理对烤烟产质量、黑胫病以及根际微生物代谢功能多样性的影响。结果表明：在化肥减量的条件下，配施生物有机肥能获得与常规化肥处理(T1)相近或更高的产量和产值，并显著提高了烤烟的上等烟比例，减轻黑胫病的危害。其中，以化肥减量20%配施0.3 kg/m2生物有机肥（T3）处理表现最好。随着生物有机肥施用量的增加，烤烟根际细菌、放线菌数量、微生物碳源利用强度、Shannon指数和McIntosh指数均呈现增加的趋势。与T1相比，T3处理的根际放线菌数量和碳源利用强度分别增加了112.6%、24.3%，并且McIntosh均匀度指数增加了17.5%。主成分分析表明，施用生物有机肥明显改变了烤烟根际微生物的群落功能，相对于糖类和酚类，氨基酸类、羧酸类、聚合物类、胺类的代谢对生物有机肥的施入更为敏感。与其他两个处理相比，T3处理明显提高了烤烟根际微生物对氨基酸类、酚类碳源的利用能力。

生物有机肥；烤烟黑胫病；根际微生物代谢功能多样性；碳源利用

土传病害是影响烟叶品质最重要的因素之一。土传病害发生的根本原因是土壤微生物区系和多样性失调，导致土壤中病原菌激增而引发土传病害严重发生[1]。长期施用化肥可导致土壤肥力下降，同时又使土壤微生态系统失衡，致使土传病害泛滥，大量使用农药等化学药剂又增加了农田生态系统失衡的风险[2-3]。近20多年来，有机肥与化肥协同施用一直是肥料研究的热门领域。生物有机肥以其调控微生物区系降低土传病害受到国内外肥料研究者的关注[4-5]。研究证实生物有机肥对番茄[6-7]、香蕉[8]、棉花[9]等作物能改善土壤微生物区系，提高其代谢活性，防治土传病害，并提高农产品产量和品质。

烤烟是我国重要的经济作物。烟草黑胫病是常见的土传真菌性病害。前期研究表明，在田间条件下，与有机肥相比，生物有机肥能提高烤烟烟叶的产量和上中等烟比例，提高烤烟根际微生物的代谢活性，并有效降低青枯病的危害程度[10-11]。然而通过田间小区试验研究不同比例生物有机肥与减量化肥配施对烤烟黑胫病及根际微生物代谢功能多样性的影响尚未见报道。本试验拟通过田间小区试验，研究不同比例生物有机肥对烤烟黑胫病以及根际微生物代谢功能多样性的影响，探讨生物有机肥的控病机制，确定生物有机肥与化肥配施的合理比例，以期为生物有机肥在绿色烤烟生产上的应用及减肥增效提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验地点

试验于2012年5～9月在云南省文山市麻栗坡县大坪镇烟叶收购站试验田（23°07’ 18.1″ N 104°37’ 01.0″ E）进行。

1.2 试验材料

1.2.1 供试品种与土壤

供试烤烟品种为云烟87，供试土壤基本理化性状见表1。

表1 供试土壤基本理化性质Tab.1 Properties of the sampled soil

1.2.2 供试肥料

供试化肥为烟草专用肥，其中基肥总养分比例为氮(N)8%、磷(P2O5)15%、钾(K2O)22%，追肥为氮(N)15%、磷(P2O5)0%、钾(K2O)33%；生物有机肥为“爸爱我”烟草专用抗土传病害生物有机肥，由江苏新天地生物肥料工程中心有限公司提供(生物有机肥含有机质≥25%､氮(N)3.2%、磷(P2O5)1.4%、钾(K2O)1.4%､抗病菌种多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)有效活菌数≥0.5亿/g)。

1.3 试验设计

试验共设置3个处理:T1:当地常规施肥(100%NPK化肥)；T2:90%NPK化肥+0.15 kg/m2生物有机肥；T3:80%NPK化肥+0.3 kg/m2生物有机肥。3次重复，共计9个小区。每个小区5垄，每垄植烟8株，每个小区种烟40株，株行距为55 cm×120 cm，小区面积29.7 m2，随机区组排列。

当地常规化肥处理(T1)氮肥用量按105kg N/hm2施入，其中基肥60kg N/hm2，追肥45kg N/hm2，总养分比例为(m(N)∶m(P2O5)∶m(K2O)=1:1:2.5，生物有机肥处理的化肥基、追肥在常规化肥(T1)的基础上按相应比例减量施入。生物有机肥做基肥在移栽前一次性施入，环施覆土。

试验中不使用防治烤烟土传病害的农药，其他技术措施按优质烟生产技术要求操作和管理。

1.4 取样与分析方法

1.4.1 烤烟分级

分别将各小区烟叶于适烤期挂牌采烤，计算各处理小区的产量，并按当地收购价格计算各处理产值。依据国家烟叶标准[12]分级后计算上等烟比例。

1.4.2 病害调查

根据文献[13]在脚叶成熟期对烤烟黑胫病进行病害调查并分级，并计算病情指数。

病情指数=∑(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×最高级值)×100

1.4.3 土壤取样

于烤烟最后一次采烤结束后采用棋盘采样法选取采样点，利用抖土法采集根际土样，混匀，用无菌自封袋包装，立即带回实验室，放入4℃冰箱保鲜，用于微生物数量的平板培养和微生物功能多样性分析。

1.4.4 可培养微生物数量的测定

可培养微生物数量分析采用稀释平板计数法进行。细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基､真菌采用马丁式培养基､放线菌采用改良高氏一号培养基进行培养[14]。

1.4.5 微生物代谢功能多样性分析

采用BIOLOG ECO 碳素利用法研究不同处理对烤烟根际土壤微生物代谢功能多样性的影响。具体方法参照文献[15]。

1.4.6 统计方法

采用Microsoft Excel 2007整理后，用SPSS11.5软件进行方差分析(Duncan 检验法)和主成分分析(PCA)，差异显著性水平设为α= 0.05。

2 结果

2.1 生物有机肥对烤烟产质量的影响

从表2可以看出，在田间条件下，与常规化肥(T1)相比，在化肥减量的条件下配施生物有机肥能显著提高烤烟上等烟比例。产量和产值均呈现出化肥减量20%配施0.3 kg/m2生物有机肥(T3)＞化肥减量10%配施0.15 kg/m2生物有机肥(T2)＞常规化肥(T1)的趋势，但处理间差异均没有达到统计学意义水平(P＞0.05)。与T1相比，T3处理的上等烟比例显著增加了12.4%(P=0.027)，与T2的差异没有统计学意义。

表2 不同施肥处理对烤烟经济指标的影响Tab.2 Effects of different fertillizer treatment on flue-cured tobacco

2.2 生物有机肥对烤烟黑胫病病情指数的影响

与常规化肥(T1)相比，在化肥减量的条件下，配施生物有机肥均能显著降低黑胫病病情指数。与T1相比，T2和T3处理的黑胫病病情指数分别下降了7.9%(P＜0.05)和10.7%(P=0.001)。T2与T3处理间差异没有统计学意义(P＞0.05)。

2.3 生物有机肥对烤烟根际可培养微生物数量的影响

从表3可以看出，施用生物有机肥的根际细菌数量呈现出T3＞T2＞T1的趋势，但处理间未达显著差异水平(P＞0.05)。

施用生物有机肥显著提高了烤烟根际放线菌的数量。与T1相比，T3处理的烤烟根际放线菌数量显著增加了112.6%(P=0.01)，与T2处理的差异没有统计学意义(P＞0.05)。

施用生物有机肥的烤烟根际真菌数量变化不大，T2处理根际真菌数量较T1有一定增加的趋势，T3处理与T1处理真菌数量基本一致，处理间没有统计学意义(P＞0.05)。

图1 不同施肥处理对烤烟黑胫病影响Fig.1 Effects of different fertilizer treatment on black shank

表3 不同处理对烤烟根际土壤细菌､放线菌､真菌的影响Tab.3 Effects of different treatment on rhizospheric bacterium,actinomycetes and fungus

2.4 生物有机肥对烤烟根际微生物代谢功能多样性的影响

2.4.1 生物有机肥对烤烟根际微生物总的碳源利用强度的影响

图2是以ECO微平板培养120h的碳源利用强度评价了不同处理的烤烟根际微生物的代谢活性。从图2可以看出，生物有机肥对烤烟根际微生物碳源利用活性有显著影响。与常规化肥(T1)相比，T3处理的碳源利用强度提高了24.3%(P=0.01)。T2处理(P＞0.05)。

图2 不同施肥处理下的碳源利用强度Fig.2 Carbon source utilization under different fertilizer treatment

2.4.2 生物有机肥对烤烟根际微生物6类碳源利用能力的影响

从不同处理碳源利用强度百分比(图3)来看，不同处理的烤烟根际微生物碳源利用强度中以糖类、氨基酸类、羧酸类、聚合物类的利用比例较高，以酚类和胺类的利用比例较低。与常规化肥处理(T1)相比，配施生物有机肥处理根际微生物的糖类碳源的利用强度百分比均下降了4.4%。与T1相比，化肥减量20%配施0.3kg/m2生物有机肥处理(T3)的氨基酸类和酚类碳源的利用强度百分比分别增加了2.1%和1.3%。

图3 不同施肥处理在Biolog-ECO板上的碳源利用强度百分比Fig.3 The percentage of carbon source utilization intensity on Biolog-ECO under different fertilizer treatment

图4是以不同类型碳源的AWCD值评价了不同施肥处理烤烟根际微生物对糖类､羧酸类､氨基酸类､胺类､聚合物类和酚类6类碳源利用能力的差异。总体来说，除糖类和聚合物无显著差异外，施用生物有机肥的烤烟根际微生物对其他类碳源的利用能力均呈现增加的趋势。施用生物有机肥显著提高了烤烟根际微生物对羧酸类、胺类碳源的利用能力。与常规化肥(T1)相比，T3处理的羧酸和胺类碳源的利用能力分别增加了30.1%(P=0.01)和54.7%(P=0.001)，与T2之间没有统计学意义。与常规化肥(T1)相比，在化肥减量20%的条件下配施0.3 kg/m2生物有机肥(T3)还显著提高了烤烟根际微生物对氨基酸类、酚类碳源的利用能力，增幅分别达39.6%(P＜0.05)和77.2%(P=0.001)。

图4 不同施肥处理下烤烟根际微生物的不同类型碳源利用率Fig.4 Carbon source utilization rate of rhizospheric microbial under different fertilizer treatment

2.4.3 烤烟根际微生物群落多样性指数比较

图5是以Shannon多样性指数和McIntosh均匀度指数比较了不同施肥处理的微生物群落结构变化。在减量化肥条件下，配施生物有机肥显著提高了植烟土壤根际微生物多样性指数和均匀度指数。与常规化肥(T1)相比，T3处理的多样性指数和均匀度指数分别增加了 2.9%(P＜0.05)和 17.5%(P＜0.05)。

图5 不同处理土壤微生物群落功能多样性指数Fig.5 Functional diversity index of soil microbial group under different treatment

2.4.4 不同处理烤烟根际微生物碳源利用主成分分析

应用主成分分析是根据各种碳源的因子权重值，可清晰地看出各处理在碳源利用上的具体差异，评价引起各处理间土壤微生物群落差异的主要碳源。通过主成分分析可以在降维后的主元向量空间中，用点的位置直观地反映出不同土壤微生物群落功能多样性变化[22]。应用主成分分析( PCA)从31个变量中提取2个主成分因子，第1主成分(PC1)和第2主成分(PC2)分别可以解释所有变量的62.38%和37.62%，2个主成分累计方差贡献率达到100%，可以以2个主成分表征原来31个变量的特征。因此，取2个主成分（PC1和PC2）得分作图来表征微生物群落碳源代谢特征（图6）。

从图6可以看出，各处理间的碳源利用得分差异明显，分别位于不同的三个象限。施用生物有机肥(T2,T3)处理在PC1上的得分较高，即位于第1,4象限；常规化肥处理(T1)在PC1和PC2上的得分均较低，位于第2象限。T3处理在PC1和PC2上的得分均较高，位于第1象限，表明T3处理对PC1和PC2上的主要碳源均影响较大。此外，T2和T3处理在PC1上的得分均为正值，而T1处理在PC1上的得分为负值，表明PC1上的碳源是区分施用生物有机肥的敏感碳源；T1处理在PC2上的得分近似为“0”，T2在PC2上的得分为负值，而T3在PC2上的得分为正值，表明PC2上的碳源是区分生物有机肥施用量的敏感碳源。

主成分得分系数与单一碳源光密度值的相关分析结果(表4)表明，糖类在PC1和PC2上的相关性均较高(系数＞0.8)，且PC1和PC2上的碳源均为3个；氨基酸类、羧酸类、聚合物类、胺类在PC1上相关性较高的碳源均多于与PC2相关性较高的碳源个数；酚类在PC1上相关性较高的碳源与PC2相等。表明氨基酸类、羧酸类、聚合物类、胺类这4类碳源是区分施用生物有机肥的敏感碳源，而糖类、酚类这2类碳源是区分生物有机肥施用量的敏感碳源。

图6 不同施肥处理对烤烟根际微生物群落功能主成分分析Fig.6 Analysis of main content of rhizospheric microbial group under different fertilizer treatment

表4 ECO 微孔板中与PC1 和 PC2 上相关性较高的主要碳源Tab.4 Carbon source highly related to PC1 and PC2 on ECO microplate

3 结论与讨论

3.1 生物有机肥对烤烟产质量的影响

作物的产量与品质与土壤中的有效营养元素密切相关[16-17]。由于有机(类)肥料原料来源丰富，不同有机肥料的养分含量也各不相同，因此有机(类)肥料替代部分化肥需要确定合适的替代比例[5,18]。有研究表明，有机肥替代50%化肥能获得与单施化肥相当甚至更高的水稻产量[19-20]。也有研究表明，随着有机肥替代无机肥纯氮比例(20%～40%)的增加，烤烟产量反而有所下降[21]。本研究结果表明，在化肥减量20%的条件下，配施生物有机肥能提高烤烟的上等烟比例，且降低烤烟黑胫病的危害程度，以减量20%的化肥配施0.3kg/m2生物有机肥表现最好。有机(类)肥料替代化肥的最适比例因作物种类与品种、土壤类型和肥料种类的差异而有所不同，要确定一个最适比例是很困难的。尤其是这一比例是否能适应长期定位试验，还有待进一步验证。

3.2 生物有机肥对烤烟根际微生物数量及碳源利用能力的影响

本研究结果表明，随着生物有机肥施用量的增加，烤烟根际细菌和放线菌数量都呈现明显增加的趋势，且真菌的数量能维持在一个低的水平。作物对土传病害的抗性与根际土壤微生物关系密切。目前很多学者认为，对土传病害的抑制在一定程度上是土壤微生物群体的作用[22]，根际土壤中的细菌及放线菌是生物防治的贡献者，通过它们对病原菌的拮抗作用抑制或直接杀死病原菌的菌丝及孢子[1,23]。土壤中细菌和放线菌密度是土壤的生物活性的重要指标，而土壤真菌密度上升是地力衰竭的标志之一[23-24]。随着生物有机肥替代化肥比例的增加，有利于促进细菌、放线菌成为土壤微生物群落中的优势群体，又稳定真菌数量，这可能是生物有机肥控制烤烟土传病害的重要机制之一。

很多研究表明，土壤微生物群落的代谢活性与作物发病情况有较好的一致性[6,23]。随着生物有机肥替代化肥比例的增加，烤烟根际微生物群落的代谢活性也呈现出增加的趋势，这与烤烟黑胫病病情指数下降的趋势相吻合。其原因可能是生物有机肥的施用使得有益微生物的碳源利用强度增加，与土传病原菌形成“营养竞争”，从而使病原菌得不到足够的营养物质进而不能大量繁殖[24]。在化肥减量的条件下，配施生物有机肥降低了糖类碳源在烤烟根际微生物总的碳源利用强度中的百分比，董艳[25]等研究认为糖类碳源的利用强度降低是施氮增加蚕豆枯萎病抗性的机制之一。因此，这也可能是生物有机肥控制黑胫病的重要机制之一。生物有机肥施用量的增加还显著提高了烤烟根际微生物的Shannon指数和McIntosh均匀度，促进了烤烟根际微生物区系向健康的方向转变。这对于增加烤烟对黑胫病的抗性有着重要意义。

BIOLOG主成分分析表明，施用生物有机肥的敏感碳源是氨基酸类、羧酸类、聚合物类、胺类，说明施用生物有机肥能够提高烤烟根际微生物对这4类碳源的利用能力。有研究认为，天冬酰胺、苯丙氨酸、苏氨酸、精氨酸能够促进尖孢镰刀菌孢子萌发和菌丝生长[1]。因此，施用生物有机肥提高了根际微生物对氨基酸类碳源的利用能力可能对降低黑胫病病情指数有一定作用。而糖类、酚类这2类碳源是区分生物有机肥施用量的敏感碳源，即随着生物有机肥施用量的增加，烤烟根际微生物利用酚类的能力也呈现显著增加的趋势。烟草土壤酚类物质的积累可能是导致烟草连作障碍的原因之一，而施用生物有机肥可促进土壤中以酚类为碳源的微生物类群的繁殖，可在一定程度上减轻烟草连作障碍[23]，这可能是生物有机肥施用量增加能减轻烤烟黑胫病危害程度的重要机制之一。

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Effects of bio-organic fertilizer on flue-cured tobacco black shank and diversity of rhizospheric microbial metabolic function

ZHANG Yunwei1,XU Zhi1,TANG Li1,LI Yanhong1,SONG Jianqun1,YIN Honghui2
1 College of Resources and Environmental Science,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China；
2 Yunnan Wenshan Tobacco company,Wenshan 663000,China

Field experiment was carried out to compare effects of applying different fertilizers on tobacco yield and quality,black shank and rhizospheric microbial functional diversity.Results showed that applying bio-organic fertilizer with reduced chemicals had a higher or approximately the same yield and quality of tobacco than conventional chemical fertilization(T1).It also increased proportions of high grade tobacco leaves and reduced hazards of black shank significantly.The best effect was found when applying 0.3 kg/m2 bio-organic fertilizer with 20% reduction of chemical fertilization(T3).With the rise of application rate of bio-organic fertilizer,the number of bacteria,actinomyces,carbon utilization intensity,Shannon and McIntosh index increased.As compared with T1,the actinomyces numbers and carbon utilization intensity of T3 treatment were significantly increased by 112.6% and 24.3% and the McIntosh index was increased by 17.5%.Principal component analysis demonstrated that applying bio-organic fertilizer changed the rhizospheric microbial metabolic function,and metabolism of amino acids,carboxylic acids,polymers and amines was more sensitive to bio-organic fertilizers compared with carbohydrates and phenols.T3 increased capacity of microbes in using carbon source of amino acids and phenols significantly as compared with T1 and T2.

bio-organic fertilizer; tobacco black shank; rhizospheric microbial metabolic functional diversity; carbon source utilization

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.05.010

S144.1 文献标志码：A 文章编号：1004-5708（2014）05-0059-07

公益性行业(农业)科研专项基金项目(201103004、201103003); 国家科技支撑计划项目(2012BAD14B01)

张云伟(1989—)，在读硕士研究生，从事植物营养与土壤微生物研究，Email:zyw525448326@126.com

汤利(1964—)，博士，教授，博士生导师，主要从事植物营养与病害控制研究，Email:ltang@ynau.edu.cn

2013-08-23