单宁酸对糖尿病大鼠肾组织和肾小球系膜细胞培养上清中8-OHdG及3-NT含量的影响①

魏海峰 刘 磊 芦小单 米旭光 李首庆 谭 岩 方艳秋

(吉林省人民医院中心实验室，吉林省生物治疗与基因诊断重点实验室，长春 130021)

糖尿病(Diabetes mellitus，DM)发病率逐年升高，现已成为全球日益关注的公共健康问题。长期高血糖状态下糖尿病个体可以引发各种糖尿病慢性并发症，其中，糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常见和最严重的并发症之一。DN的发病机制尚未完全阐明，且缺乏有效的治疗方法。近年来，随着糖尿病并发症统一发病机制广泛被接受，氧化应激、亚硝基化应激与DN发病的关系已成为DN研究领域新的课题。机体内氧化应激机制十分复杂，除了氧自由基本身可以导致机体损害以外，活性氧(ROS)与活性氮(RNS)生成的过氧亚硝基阴离子(ONOO－)也可以产生更强的毒性效应。ONOO－能与游离的酪氨酸或蛋白质中的酪氨酸残基发生反应，使酪氨酸硝化产生3-硝基酪氨酸(3-nitrotyrosine，3-NT)［1］。3-NT 是体内 ONOO-生成的特异性标志物，其含量可以代表组织内亚硝基化应激的水平。目前ONOO-对机体的损伤作用已引起广泛关注，但有关亚硝基化应激与DN发病的关系尚很少有报道。

祖国传统中医药在DM及其并发症的防治上具有独特的优势，我国药典上收载的单宁酸(Tannic acid，TA)具有多方面的生理活性，尤其具有显著的抗炎、抗氧化、降糖降脂、抗肿瘤等作用。我国拥有丰富的提取制备单宁酸天然资源，约70%以上的中草药、多种树木及果实中均含有此类鞣质化合物。但目前国内外关于单宁酸对DN的防治作用的研究报道很少。因此本研究通过动物实验观察单宁酸对DM模型大鼠肾脏形态和功能影响并在组织和细胞水平探讨糖尿病引起机体的氧化应激、亚硝基化应激机制及单宁酸的改善作用，为单宁酸防治DN提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 盐酸氨基胍(AG)及单宁酸(TA)均购自 Sigma公司，注射前用0.1 mol/L的PBS溶液配制2%氨基胍溶液及1%单宁酸溶液，以NaOH调整溶液的pH值为7.0，超净台下用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌备用;将牛血清白蛋白(组分Ⅴ)10 mg/ml、葡萄糖 0.5 mol/L、EDTA 1 mmol/L、青霉素100 U/ml和链霉素100 μg/ml溶于 pH7.2 PBS，过滤除菌，37℃恒温避光孵育2个月，透析除糖后制备糖化牛血清白蛋白(AGEs)，同样条件下孵育的不含葡萄糖牛血清白蛋白(BSA)作为阴性对照。DMEM培养基(Gibco)，小牛血清(FBS，天津灏洋生物技术有限公司)，胰蛋白酶(Gibco)，大鼠8-OhdG及3-NT试剂盒(美国RND公司)，CO2培养箱(SHEL-LAB)，XSB-1A倒置生物显微镜，DG5031型酶联免疫检测仪。大鼠肾小球系膜细胞株HBZY-1，由吉林大学基础医学院病理生理学教研室惠赠。

1.2 动物实验 健康雄性Wistar大鼠68只(由吉林大学实验动物中心提供)，体重(190±12)g，6周龄。常规饲料适应性饲养1周后，随机选取8只作为正常对照组，其余60只给予高糖高脂饲料喂养，4周后造模，造模前禁食12 h，正常对照组大鼠腹腔注射等体积0.1 mol/L柠檬酸盐缓冲液，其余大鼠用链脲佐菌素(STZ，购自Sigma公司)按52 mg/kg体重(使用前用0.1 mol/L、pH4.2无菌柠檬酸盐缓冲液配成2%溶液)单次腹腔注射，72 h后监测血糖、尿糖，尿糖+++以上及尾静脉随机血糖≥16.7 mmol/L为糖尿病成模标准。将造模成功的大鼠进一步随机分为模型组、氨基胍组、单宁酸低剂量组、单宁酸高剂量组，每组15只。给药方法:氨基胍组及单宁酸低高剂量组分别腹腔注射AG［40 mg/(kg·d)］及TA［20及30 mg/(kg·d)］，正常对照组和模型组给予生理盐水［30 mg/(kg·d)］，为期10周。实验期间动物自由进食饮水，未使用胰岛素及其他降糖药物。实验结束时处死动物，眼球取血，2000 r/min离心10 min，吸取血清分装于 Eppendorf管中，－20℃冰箱保存备用。摘取肾脏，左右肾去除包膜，生理盐水洗去血迹后称重，用锋利刀片将肾脏自肾门处冠状切面对半剖开，一半分装入标本袋，立即放入液氮中速冻，而后－80℃保存备用。另一半肾脏放入4% 多聚甲醛中固定48 h，常规制备石蜡切片。

1.3 细胞培养 将大鼠GMC株接种于含10%胎牛血清(FBS)、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的DMEM低糖培养基中，37℃，5%CO2及饱和湿度条件下培养，细胞生长至亚汇合状态时，更换为含0.5%FBS的DMEM低糖培养基继续培养24 h，使细胞同步化。然后将细胞分为以下几组:正常糖组(Normal glucose，NG)，含 5.6 mmol/L D-葡萄糖;高糖组(High glucose，HG)，含 30 mmol/L D-葡萄糖;甘露醇组，含25 mmol/L甘露醇;AGEs及BSA组:将AGEs或BSA加入低糖 DMEM培养液中，使AGEs及BSA终浓度为250 mg/L;药物处理组:在高糖或AGEs处理的同时加入药物，单宁酸(TA)分为10、20、40 及 80 μmol/L 4 个浓度组;氨基胍(AG)作为阳性对照药，终浓度为250 μmol/L。给药后继续培养48 h，留取细胞培养上清。

1.4 观察指标及方法

1.4.1 肾脏形态学观察 常规进行肾脏HE染色，光镜下观察肾小球大小、结构、系膜细胞数量、系膜基质增生情况等。

1.4.2 肾脏功能测定 采用日立7150型全自动生化仪检测各组大鼠血清肌酐(Cr)、血尿素氮(BUN)、尿酸(UA)水平及尿蛋白(Urine protein)，计算24 h尿蛋白排泄量。

1.4.3 肾组织匀浆8-OHdG及3-NT含量测定 双抗体夹心法，按照试剂盒说明书操作。

1.4.4 细胞培养上清中8-OHdG及3-NT含量测定同上。

2 结果

2.1 单宁酸对糖尿病大鼠肾脏形态的影响 光镜下见正常对照组大鼠肾小球无明显异常，系膜细胞和系膜基质无明显增生，毛细血管袢开放，肾小球囊无渗出及粘连，肾间质无明显炎细胞浸润，肾小管结构正常。DM模型组肾小球体积增大，系膜基质增多，部分毛细血管受压而塌陷，肾小管管腔扩张，上皮细胞空泡变性。单宁酸处理组较DM模型组有很大程度改善，肾小球体积增大不明显，仅有轻度系膜增生，绝大多数毛细血管腔开放，见图1。

图1 各组大鼠肾脏HE染色比较(×400)Fig.1 Comparison of HE staining of rat kidney in different groups( ×400)

2.2 单宁酸对糖尿病大鼠肾脏功能的影响 各组DM大鼠血清Cr、BUN、UA含量和24 h尿蛋白排泄量均明显高于对照组，单宁酸处理10周后的DM大鼠，血清Cr、BUN和尿蛋白排泄量均不同程度改善，见表1。

表1 各组大鼠肾功能生化指标(，n=6)Tab.1 Biochemical parameters of renal function in different groups(，n=6)

表1 各组大鼠肾功能生化指标(，n=6)Tab.1 Biochemical parameters of renal function in different groups(，n=6)

Note:Compared with Control group，1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;Compared with DM group，3)P ＜0.05，4)P ＜0.01.

Groups Cr(μmol/L)BUN(mmol/L)UA(μmol/L)Urinary protein(mg/24 h)Control 66.00±5.74 4.76±1.38 62.20±7.76 8.67±1.90 DM 134.36±18.222)16.60±4.042)106.52±14.022)27.20±3.462)AG 109.40±15.962)12.30±3.232)88.40±11.671)18.95±3.222)4)TA20 105.40±14.992)3)10.86±1.971)3)85.18±8.301) 22.31±2.222)TA30 93.70±9.771)4)11.00±1.731)3)90.34±14.782)21.17±2.972)3)

2.3 单宁酸对糖尿病大鼠肾组织匀浆8-OHdG含量的影响 正常对照组大鼠肾组织8-OHdG含量较少;DM模型组大鼠肾组织8-OHdG含量较正常对照组明显增多(P＜0.01);低剂量单宁酸处理组(TA20)大鼠肾组织8-OHdG含量与DM模型组比较，减少不明显，无统计学意义;而高剂量单宁酸处理组(TA30)大鼠肾组织8-OHdG含量较DM模型组明显减少(P＜0.05)，具有统计学意义，且与正常对照组比较无明显差别(P＞0.05)，见表2。

表2 大鼠肾组织匀浆中8-OHdG及3-NT含量(，n=3)Tab.2 Contents of 8-OHdG and 3-NT in nephridial homogenate of rats(，n=3)

表2 大鼠肾组织匀浆中8-OHdG及3-NT含量(，n=3)Tab.2 Contents of 8-OHdG and 3-NT in nephridial homogenate of rats(，n=3)

Note:Compared with Control group，1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;Compared with DM group，3)P ＜0.05.

Groups 8-OHdG(ng/L) 3-NT(nmol/L)Control 22.63±8.66 75.94±16.79 DM 54.22±7.992) 118.63±4.572)AG 47.40±5.902) 93.31±13.823)TA20 40.96±9.331) 97.91±5.281)TA30 33.18±12.113) 94.51±13.603)

2.4 单宁酸对糖尿病大鼠肾组织匀浆3-NT含量的影响 由表2可以看出，DM模型组大鼠肾脏组织3-NT含量较正常对照组明显增多(P＜0.01)，与DM模型组相比，氨基胍组(AG)和高剂量单宁酸处理组(TA30)大鼠肾组织3-NT的含量明显减少(P＜0.05)，与对照组无明显差别(P＞0.05)。

2.5 单宁酸对GMC培养上清中8-OHdG含量的影响

2.5.1 单宁酸对高糖培养GMC培养上清中8-OHdG含量的影响 正常糖组培养上清中氧化应激标志物8-OHdG含量较少，高糖组8-OHdG含量较正常糖组明显增多(P＜0.01);氨基胍及单宁酸组培养上清中8-OHdG含量较高糖组有所减少，其中80 μmol/L单宁酸组8-OHdG含量显著减少，与高糖组比较具有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

表3 高糖培养条件下GMC培养上清中8-OHdG及3-NT含量(，n=3)Tab.3 Contents of 8-OHdG and 3-NT in supernatant of GMC cultured in high glucose conditions(，n=3)

表3 高糖培养条件下GMC培养上清中8-OHdG及3-NT含量(，n=3)Tab.3 Contents of 8-OHdG and 3-NT in supernatant of GMC cultured in high glucose conditions(，n=3)

Note:Compared with NG group，1)P ＜0.05，2)P ＜0.01;compared with HG group，3)P ＜0.05.

Group Dose(μmol/L) 8-OHdG(ng/L) 3-NT(nmol/L)NG 43.02±3.95 88.49±8.34 HG 57.11±5.302) 120.82±6.272)HG+AG 250 53.35±3.291) 110.86±5.621)HG+TA 10 56.47±2.502) 114.67±6.032)20 49.70±2.64 102.16±13.603)40 51.16±6.68 105.98±14.461)80 48.34±6.363) 100.61±8.793)

表4 AGEs培养条件下GMC培养上清中8-OHdG及3-NT含量(，n=3)Tab.4 Contents of 8-OHdG and 3-NT in supernatant of GMC cultured in AGEs conditions(，n=3)

表4 AGEs培养条件下GMC培养上清中8-OHdG及3-NT含量(，n=3)Tab.4 Contents of 8-OHdG and 3-NT in supernatant of GMC cultured in AGEs conditions(，n=3)

Note:Compared with BSA group，1)P ＜ 0.05，2)P ＜0.01;compared with AGEs group，3)P ＜0.05，4)P ＜0.01.

Group Dose(μmol/L) 8-OHdG(ng/L) 3-NT(nmol/L)BSA 47.57±2.41 94.05±10.28 AGEs 61.97±6.992) 117.38±13.622)AGEs+AG 250 53.88±3.253) 104.52±8.41 AGEs+TA 10 57.43±3.022) 109.75±2.831)20 55.79±2.781) 110.30±4.671)40 52.81±3.233) 98.86±7.833)80 52.44±3.584) 101.61±9.773)

2.5.2 单宁酸对AGEs培养条件下GMC培养上清中8-OHdG含量的影响 BSA对照组细胞培养上清中8-OHdG含量较少，加入200 mg/L的AGEs刺激后，细胞培养上清中8-OHdG含量较BSA组明显增多(P＜0.01);氨基胍及单宁酸处理组8-OHdG含量均显著减少，与AGEs组相比具有统计学意义。可见单宁酸可以减少AGEs引起的细胞氧化应激增加，且这种作用呈一定浓度依赖性，见表4。

2.6 单宁酸对GMC培养上清中3-NT含量的影响

2.6.1 单宁酸对高糖培养条件下GMC培养上清中3-NT含量的影响 高糖培养条件下GMC培养上清中3-NT含量增多，与正常糖组比较差异具有统计学意义(P＜0.01)，提示高糖条件下细胞亚硝基化应激水平增高。与高糖组比较，单宁酸处理组细胞培养上清中3-NT含量明显减少，其中20、80 μmol/L单宁酸组3-NT含量较高糖组明显减少(P＜0.05)，见表3。

2.6.2 单宁酸对AGEs培养条件下GMC培养上清中3-NT含量的影响 AGEs刺激可增加GMC培养上清中3-NT含量，与BSA对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.01);单宁酸处理组培养上清中3-NT含量较AGEs组有所减少，其中40 μmol/L和80 μmol/L单宁酸处理组3-NT含量与AGEs组比，差异具有统计学意义(P＜0.05)，见表4。

3 讨论

单宁酸在药典上又称鞣酸、鞣质、五倍子单宁酸，是一类复杂的高分子多元酚类化合物，由于单宁酸的分子量比较大，其成分在植物中存在相当复杂，往往同一植物内同时存在不同结构而性质相近的各种单宁酸，加之其化学结构大多不稳定，给中药制剂的提纯、液体药剂的澄明度都带来很多麻烦。在多数情况下，一般都作为杂质除去。近年来，由于天然有机化合物分离、精制技术的提高，药理实验动物模型的不断出现，逐渐成熟，大量研究不仅阐明了千余种新的单宁酸化合物结构，而且发现单宁酸具有多方面的药理作用。除常见的收敛、抗菌消炎、止血、驱虫、止泻、抗多种病原体感染外，还表现出抗肿瘤、抗突变、抗脂质过氧化、抗变态反应及降压、降脂、改善肝肾功能等作用［2，3］。本研究结果显示，单宁酸可有效改善糖尿病大鼠肾组织病理改变及改善肾功能，从而延缓DN的发生和进展。

大量动物实验和临床研究表明，采取抗氧化治疗可以有效延缓DN的发生和发展。除了常用的抗氧化型维生素C和维生素E、GSH、ACEI和ARB类药物外，许多中药也具有抗氧化活性。单宁酸的多元酚类结构赋予它一系列独特的化学性质，使其成为一类重要的天然活性物质，其中最引人注目的是它在抗氧化和清除自由基方面表现出的比其他抗氧化剂更强的活性。周本宏等［4］研究发现，石榴皮中提取的单宁酸对羟自由基和超氧阴离子自由基均具有较好的清除作用，较低浓度时即可发挥清除作用。王川［5］探讨葡萄籽单宁在体外对油脂的抗氧化和清除活性氧自由基的能力，并与一些天然抗氧化剂作比较。结果表明葡萄籽单宁的抗氧化能力效果强于柠檬酸和维生素C。本次研究结果表明，单宁酸可以减少大鼠肾组织8-OHdG水平。因此我们推测，单宁酸对DM大鼠肾脏病变的改善作用，可能是通过清除大鼠肾组织内氧自由基，提高抗氧化酶的活性，从而降低大鼠体内氧化应激水平而实现的。

过氧亚硝基阴离子(ONOO－)是一种很强的细胞毒性物质，是一种强氧化剂和硝化剂，能以多种方式对机体产生细胞毒作用。在氧化、过氧化、亚硝基化等综合作用下可以引发脂质过氧化、蛋白质损伤、酶失活、DNA损伤、细胞膜和线粒体膜变性及小分子抗氧化剂的损耗等［6-8］。ONOO－引发体内白质酪氨酸残基的硝化，产生3-硝基酪氨酸(3-NT)。在正常生理条件下，也可发生酪氨酸残基的硝化反应，而病理条件下3-NT的水平通常会升高。目前已在50多种疾病的病变组织或体液中检测到3-NT的存在［9-11］。研究发现ONOO－可损伤胰岛β细胞，因此认为 ONOO－可能是糖尿病发病的一个重要因素［12］。齐锦生等［13］在DM大鼠骨及体外高糖培养的成骨细胞(OB)中检测到iNOS及ONOO－的高表达，提示ONOO－的增加可能是造成糖尿病骨质疏松的机制之一。Xiao等［14］研究发现链脲佐菌素诱导的糖尿病模型大鼠的肾脏TNF-α水平、NO含量、iNOS表达及3-NT含量均显著增加，氨基胍可作为ONOO－清除剂改善糖尿病组大鼠的肾小球病变及肾功能。本研究在DM大鼠肾组织中检测到3-NT含量增高，也证明了机体内活性氧和活性氮生成过量ONOO－，进而硝化蛋白质酪氨酸残基可能是DN发病的另一重要原因。体外实验结果发现，在高糖及AGEs诱导下，GMC细胞培养上清中也检测到过量的硝基应激标志物3-NT，在细胞水平验证了这一结论。

近年来ONOO－在各种疾病发病中的作用及损害程度受到重视，如何对抗ONOO－引起的损伤已引起了广大学者的广泛关注。目前对抗ONOO－的方法主要有防止、清除及修复三种。最新的国外研究表明，采用ONOO－清除剂或蛋白质硝化抑制剂可有效改善糖尿病的外周血管和神经病变［15，16］。本实验检测到单宁酸处理组培养上清中3-NT含量较高糖组及AGEs组明显减少，推测可能是单宁酸通过提高抗氧化酶的活性，抑制O2的生成，或者通过抗炎作用，抑制NO和O2生成过量的ONOO－，进而抑制蛋白质被过度亚硝基化。具体的作用机制需要进一步在体外实验及分子水平的研究中进行验证。总之，加强对ONOO-引起组织或细胞损伤的基础研究，特别是开展针对抗ONOO－损伤作用和有效清除体内ONOO－的新药开发，将有助于进一步揭示DN发病的分子机制，为临床防治DN提供新的策略。关于单宁酸是一种有效的抗氧化剂的报道较多，本次试验发现单宁酸也可显著减少糖尿病模型大鼠肾组织匀浆及体外高糖或AGEs刺激的肾小球系膜细胞培养上清中3-NT含量，说明单宁酸也是一种有效的抗硝化剂。

亚硝基化应激与氧化应激密切相关，单宁酸可以同时降低机体氧化应激和亚硝基化应激水平，进一步证明单宁酸是一种作用明显的抗氧化剂和抗硝化剂。单宁酸具有肾脏保护作用，推测与其提高糖尿病大鼠的抗氧化能力，降低糖尿病大鼠的亚硝基化应激水平有关。中药治疗糖尿病具有悠久的历史，正确应用现代药理学方法，深入系统地研究中药防治糖尿病及其并发症的有效物质及作用机制，是推进中药现代化进程的重要工作。单宁酸资源丰富，药理活性多，在防治糖尿病及其并发症方面具有较好的应用前景。

［1］Corpas FJ，Barroso JB.Peroxynitrite(ONOO-)is endogenously produced in arabidopsis peroxisomes and is overproduced under cadmium stress［J］.Ann Bot，2014，113(1):87-96.

［2］李尚坤，傅仲学，坤 明，等.鞣酸通过下调TMEM16A的表达抑制人结肠癌细胞SW620细胞的增殖［J］.重庆医学，2014，43(1):5-8.

［3］Booth BW，Inskeep BD，Shah H，et al.Tannic Acid preferentially targets estrogen receptor-positive breast cancer［J］.Int J Breast Cancer，2013，2013:369609.

［4］周本宏，王慧媛，郭志磊，等.石榴皮鞣质对羟自由基和超氧阴离子自由基的清除作用［J］.中国医院药学杂志，2008，28(17):1442-1445.

［5］王 川.葡萄籽单宁的抗氧化性研究［J］.食品科技，2009，34(2):184-187.

［6］Pilon G，Charbonneau A，White PJ，et al.Endotoxin mediated-iNOS induction causes insulin resistance via ONOO-induced tyrosine nitration of IRS-1 in skeletal muscle［J］.PLoS One，2010，5(12):e15912.

［7］Ma S，Zhang Z，Yi F，et al.Protective effects of low-frequency magnetic fields on cardiomyocytes from ischemia reperfusion injury via ROS andNO/ONOO-［J］.OxidMedCellLongev，2013，2013:529173.

［8］郝丽娜，王 敏，马军玲，等.葛根素通过下调过氧亚硝基阴离子水平和诱导型一氧化氮合酶表达来减少糖尿病大鼠视网膜色素上皮细胞凋亡(英文)［J］.生理学报，2012，64(2):199-206.

［9］Kayacelebi AA，Nguyen TH，Neil C，et al.Homoarginine and 3-nitrotyrosine in patients with takotsubo cardiomyopathy［J］.Int J Cardiol，2014，173(3):546-547.

［10］Zhang YL，Wei JR.3-nitrotyrosine，a biomarker for cardiomyocyte apoptosis induced by diabetic cardiomyopathy in a rat model［J］.Mol Med Rep，2013，8(4):989-994.

［11］韦金儒，张雅莉.3-硝基酪氨酸与糖尿病心肌病大鼠心肌细胞凋亡的关系研究［J］.中国病理生理杂志，2011，27(2):243-248.

［12］Hu DH，Peng J，Zhang X，et al.Thyroid hormone exacerbates vasoconstriction in insulin resistance:The role of ONOO(-)［J］.Eur J Pharmacol，2014，5(730):41-50.

［13］齐锦生，凌亦凌，张晓琳，等.糖尿病大鼠骨质疏松与过氧亚硝基阴离子关系的免疫组化研究［J］.中国病理生理杂志，2005，21(10):2035-2038.

［14］Xiao H，Li Y，Qi J，et al.Peroxynitrite plays a key role in glomerular lesions in diabetic rats［J］.J Nephrol，2009，22(6):800-808.

［15］Cassuto J，Dou H，Czikora I，et al.Peroxynitrite disrupts endothelial caveolae leading to eNOS uncoupling and diminished flowmediated dilation in coronary arterioles of diabetic patients［J］.Diabetes，2014，63(4):1381-1393.

［16］Stavniichuk R，Shevalye H，Lupachyk S，et al.Peroxynitrite and protein nitration in the pathogenesis of diabetic peripheral neuropathy［J］.Diabetes Metab Res Rev，2014;doi:10.1002/dmrr.2549.［Epub ahead of print］