葡萄籽原花青素对脑缺血再灌注大鼠氧化应激与学习记忆的影响

王珠，赵雅宁，李建民

视空间工作记忆是工作记忆模式的一个系统，不同的脑区负责不同视空间信息的加工。视觉空间认知障碍是指由于视觉空间认识机能失调造成物体在空间内的各种特性的认识障碍，也叫视觉性空间知觉障碍[1]。研究显示，脑损伤可引起视觉空间认知障碍，临床表现为学习、记忆功能障碍，严重者导致神经退行性变甚至痴呆，不仅影响患者的生存质量，而且增加家庭和社会的经济负担，但其机制尚未明确[2]。本研究观察不同剂量葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidin extract,GSPE)预处理，对脑缺血再灌注损伤后视觉空间认知障碍的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级健康Sprague-Dawley大鼠72只，雄性，体质量(220±20)g，由中国医学科学院实验动物研究所动物资源中心提供，实验动物合格证号：0127011。常规饲养，温度(24±1)℃，湿度(55±5)%。手术前夜禁食，不禁水。

1.2 试剂和仪器

GSPE：天津市尖峰天然产物研究开发有限公司，用蒸馏水溶解成所需浓度。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)测试盒：南京建成生物工程研究所。

尼龙鱼线，直径0.235 mm：日本法可株式会社。光学显微镜：OLYMPUS。石蜡切片机：LEICA。HH-S恒温水浴锅：金坛市医疗仪器厂。KDC-1044离心机：科大创新股份有限公司中佳分公司。HANGPING FA-2004电子天平：上海天平仪器厂。S2-96自动纯水蒸馏器：上海亚荣升华仪器厂。

1.3 分组与预处理

将动物分成假手术组、模型组、GSPE低剂量组(20 mg/kg)和GSPE高剂量组(200 mg/kg)，每组18只。GSPE低、高剂量组造模前每天按设计剂量灌胃给药1次，连续4周。假手术组和模型组给予蒸馏水10 ml/kg。

1.4 模型制备

预处理4周后，参考改良Longa方法造模[3]。大鼠术前禁食12 h，用10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉。分离出右侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，结扎颈外动脉靠近分叉端。距颈总动脉分叉处约5 mm剪一小口，将鱼线从剪口处插入并旋转，使鱼线进入颈内动脉。向头端缓慢推进18～20 mm，感到有阻力时，即到达大脑前动脉，阻断大脑中动脉(MCA)的血液供应。结扎颈内动脉。2 h后抽出鱼线，血流再灌注。假手术组仅分离右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，然后缝合伤口。

术后大鼠完全清醒后参照Longa评分法[4]进行神经功能缺损评分，1～3分为造模成功。

1.5 观察指标

于再灌注后12 h、24 h、48 h每组各取6只大鼠，进行以下实验。

1.5.1 Morris水迷宫 将安全岛置于水迷宫第二象限中，加水至高过安全岛2～3 cm，水温22～25℃。由摄像机及计算机自动跟踪、拍摄和统计大鼠分别由4个象限入水后寻找到安全岛的潜伏值和穿台次数。如在90 s内未找到安全岛，则潜伏期值记为90 s。

1.5.2 HE染色 大鼠4%多聚甲醛灌注固定后取脑，截取视交叉平面至大脑横裂脑组织，常规石蜡包埋。连续冠状切片，片厚4μm，HE染色，显微镜下观察。

1.5.3 SOD测定 采用黄嘌呤氧化酶法。将冻存的脑组织匀浆样本解冻，取0.05 ml，漩涡混匀器充分混匀，37℃恒温水浴40 min，室温放置10 min，于波长550 nm处比色。计算SOD水平。

1.5.4 MDA测定 采用硫代巴比妥酸法。将冻存的脑组织样本解冻，取0.05 ml，95℃水浴40 min，流水冷却，3500～4000 r/min离心10 min，取上清，于532 nm处，1 cm光径比色。计算MDA水平。

1.6 统计学分析

采用SPSS 13.0统计分析软件进行统计分析。数据采用表示，各组间均数比较进行方差分析和t检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 HE染色

假手术组大鼠大脑皮层结构完整，细胞排列整齐。模型组大鼠缺血区可见较多肿胀神经元，部分神经元胞核完全消失，形成空泡状结构，胞体缩小变形，出现核固缩和核仁消失现象，胞质变少、着色深，间质水肿明显，可见大量坏死细胞，脑组织结构破坏严重。GSPE低剂量组缺血区可见肿胀的神经元，部分出现坏死形成空泡状结构，神经元细胞出现缩小变形、核固缩和较多空泡。GSPE高剂量组可见较多残存神经细胞，神经元形态相对正常，间质水肿较轻，核固缩细胞和空泡区域明显减少。见图1。

2.2 Morris水迷宫

与假手术组比较，模型组潜伏期和穿台次数显著高于假手术组(P<0.001)。与模型组比较，GSPE低剂量组潜伏期和穿台次数差距不大，GSPE高剂量组潜伏期和穿台次数显著低于模型组(P<0.001)，也显著低于GSPE低剂量组(P<0.001)。见表1、表2。

表1 各组大鼠Morris水迷宫潜伏期(s)

表2 各组大鼠Morris水迷宫穿台次数

2.3 SOD

假手术组脑组织SOD含量各时间点间无明显变化。与假手术组相比，各时间点模型组SOD含量明显降低(P<0.05)；与模型组比较，GSPE低剂量组各时间点SOD含量略高，但无显著性差异(P>0.05)；GSPE高剂量组各时间点SOD含量高于模型组(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠SOD水平(U/mg)

图1 各组大鼠缺血区脑组织(HE染色,400×)

2.4 MDA

假手术组脑组织内MDA含量稳定。与假手术组比较，各时间点模型组MDA含量增多(P<0.05)。与模型组比较，GSPE低剂量组MDA无显著性差异(P>0.05)。GSPE高剂量组MDA低于模型组(P<0.05)和GSPE低剂量组(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠MDA水平(nmol/mg)

3 讨论

Katherine等认为，枕叶皮质－顶叶后部－前额叶神经环路参与工作记忆过程，其中背外侧前额叶参与空间工作记忆过程[5]。何婧等发现，帕金森病(PD)患者存在肯定的视觉空间工作记忆损害，且随病程进展加重[6]。姜红等发现，侧脑室注射骨髓间充质干细胞能改善癫痫持续状态大鼠的视空间记忆[7]。

本研究显示，脑缺血再灌注大鼠表现出明显视空间记忆障碍。已有研究证实，氧自由基在脑缺血再灌注损伤早期就有形成，是直接导致细胞死亡和继发性细胞死亡的主要因素[8]。氧化应激可导致记忆认知功能障碍，氧化应激强度与持续时间决定着它对学习记忆影响的程度，其机制为氧自由基增多，兴奋性氨基酸毒性增加，导致学习、记忆等脑高级功能损害[9]。裴新荣等发现，海洋胶原肽具有预防年龄造成的学习记忆能力下降的功能，其作用机制可能是抗氧化活性和促进脑源性神经营养因子(BDNF)的表达[10]。

GSPE是从葡萄籽中提取的生物类黄酮，具有极强的抗氧化和清除自由基活性，是目前发现的最强的自由基清除剂和脂质过氧化抑制剂[11]。本研究结果显示，大剂量GSPE能明显减轻脑缺血再灌注大鼠的视空间记忆功能和神经细胞损伤，对缺血再灌注损伤具有保护作用。

[1]席春华,朱幼玲,汪凯.视空间工作记忆的研究进展[J].中国神经精神疾病杂志,2008,34(7):443-445.

[2]姜巍,郑健,赵士福.缺血性脑白质损害患者视觉空间工作记忆的事件相关电位特征[J].医学研究生学报,2009,22(5):480-484.

[3]曹勇军,程彦斌.线栓法建立大鼠局灶性脑缺血/再灌注模型的改进与探讨[J].中国应用生理学杂志,2001,17(2):198-200.

[4]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occusion without cranietomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[5]Katherine L,Possin J,Vincent F,et al.Spatial and object working memory deficits in Parkinson's disease are due to impairment in different underlying processes[J].Neuropsychology,2008,22(5):585-595.

[6]何婧,陈海波.帕金森病患者的视空间功能障碍研究[J].中国神经免疫学和神经病学杂志,2013,20(1):48-51.

[7]姜红,刘献增,董建强,等.海马局部注射人骨髓间充质干细胞对癫痫持续状态后大鼠视空间记忆的影响[J].中国全科医学,2008,11(6A):943-945.

[8]王光胜,耿德勤.脑缺血/再灌注损伤机制研究进展[J].医学综述,2011,17(24):3753-3756.

[9]Feng Y,Liu YM,Leblanc MH,et al.Grape seed extract given three hours after injury suppresses lipid peroxidation and reduces hypoxic-ischemic brain injury in neonatal rats[J].Pediatr Res,2007,61(3):295-300.

[10]Pei XR,Yang R,Zhang ZF,et al.Marine collagen peptide isolated from Chum Salmon(Oncorhynchus keta)skin facilitates learning and memory in aged C57BL/6Jmice[J].Food Chemistry,2010,118(2):333-340.

[11]吴秀香,张妍,孙柳青,等.葡萄籽原花青素对肾血管性高血压大鼠血管重塑的影响[J].中国病理生理杂志,2012,28(6):1023-1027.