构建转生长素基因鲟龙鱼的研究设想

李亚芹　臧学丽　张春雨

摘要：自1985年朱作言教授率先研制出世界上首例转基因鱼以来，世界上已经有超过35种的鱼用于转基因研究，绝大多数鱼类的转基因研究以培育具有优良生产性状的新品系为目的。其中，生长激素转基因鱼由于具有生长速度快、饵料转化效率高等特点而备受关注。中华鲟是我国珍稀水产动物，具有重要的科研价值和生态意义，目前尚未得到足够的关注，笔者希望利用转基因技术，获得具有快速生长的转基因中华鲟龙鱼纯合子，筛选出优良转基因鱼新品种。采用显微注射方法，将带有黄河鲤MT基因启动顺序与大马哈鱼LGH基因的重组片段导入鲟龙鱼受精卵中，通过Northern、Southern杂交方法进行检测，希望可以促进鲟龙鱼的生长。

关键词：转LGH基因；中华鲟龙鱼；生长特性；纯合子品种

中图分类号： S965 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2014.22.0018

目前在转基因鱼的研究中，转生长素基因得到了广泛的认知，它改变鱼的代谢特征，转移基因表达往往对受体鱼的代谢产生重要影响。例如，加快受体鱼的成长和成熟，提高繁殖速率，减少肌肉脂肪含量，改变事物利用效率以及影响能量收支平衡等[1]。

迄今为止，鱼类基因的转移研究大多使用生长素基因。生长素基因可以在受体鱼中整合与表达，表达的生长素基因能够促进多种受体鱼的生长。进一步研究结果显示，基因表达的生长素基因通过降低代谢能占摄食的比例及提高蛋白质的合成能积累，促进转生长素基因鱼的生长速度，受体鱼的肌肉蛋白质含量和事物转换效率得到显著提高。显然，转生长素基因鱼被改变的这些代谢特征，在渔业生产上有重要的应用价值。

鲟鱼是我国的名特优珍品，肉味鲜美、骨软、营养价值高，可以制成高钙食品及国家级名菜，利用转基因手段可以挽救这个濒临灭绝的珍贵物种，提高该鱼的研究价值和经济价值，具体设想如下。

1 材料方法

1.1 基因材料

受体鱼（吉林农大）；大马哈鱼生长素基因LGH（吉林农大）；黄河鲤金属硫蛋白启动子MT（吉林农大）。

1.2 试剂与酶

探针标记试剂盒（Promega公司）；dCTP（北京亚辉公司）；酶类（New Biolabs和华美生物工程公司）；其他试剂（全部为分析纯）。

1.3 仪器

手动显微注射器（CellTram 艾本德中国有限公司），注射针（斜面30G注射针常州市双马医疗器材有限公司）；显微镜（LW300LT 上海测维光电技术有限公司），照相机（5D Mark II佳能株式会社）。

2 实验方法

2.1 LGH的启动区删除，MT启动子的插入

将LGH用EcoRⅠ酶切，用凝胶电泳回收GH基因；将带有黄河鲤MT基因启动顺序与大马哈鱼LGH 基因顺序重组的环状基因通过EcoRⅠ酶切，将PGEM312切除，得到6.8Kb的线状融合基因，即为全鱼基因PCMTLGH。

2.2 受精卵采集、基因导入

采集鲟龙鱼受精卵，在10月中下旬中华鲟繁殖季节，对健康的亲鱼进行人工催产，采集精卵5℃条件下存放，每次取适当精、卵进行受精，在受精10分钟后至第一次卵裂前，将约10微克全鱼基因显微注射到受精卵核附近区。

2.3 鱼苗培养

将注射外源基因的受精卵置于20℃水温箱中，3～4天可孵化出鱼苗。待鱼苗平游后将其放在网箱中投喂活饵料饲养，长到约2厘米左右放入有防逃措施的鱼池中饲养至转基因鱼苗，同时对照鱼放在饲养条件相同的另一池塘饲养。第二年春经标记与对照鱼放在池塘对照饲养。

2.4 探针制备

将全鱼基因用EcoRⅠ酶切，电泳回收6.8左右的DNA条带。纯化后用放射性同位素标记。

2.5 分子杂交

一是DNA检测。待鱼苗成长后，随机捕获，剪鱼鳍条并做标记，提取DNA，每个DNA样品均为5微克，将总DNA样品点样于硝酸纤维素膜上进行斑点杂交，再将斑点杂交呈阳性的DNA样品，取10微克经限制性酶切后，转印到硝酸纤维素膜上，进行Southern印记杂交；二是RNA检测和Nortnern杂交。

3 预期结果

3.1 转大马哈鱼LGH外源基因的获得

将pUcMT与pGEMGH1进行连接、转化、筛选，获取转LGH外源基因pcMTLGH。

3.2 DNA分子杂交

3.2.1 斑点杂交 随机选取10尾注射过外源基因的中华鲟龙鱼进行Southern杂交。

3.2.2 Northern杂交 抽取4尾Southern印迹杂交呈阳性的RNA样本进行Northern印迹杂交，预期阳性全鱼基因整合后25%发生转录。

3.3 外源基因在受体鱼中的表达

在DNA杂交阳性的鱼中，检测出生长激素基因，表明外源基因在转基因鲟龙鱼中具有合成生长激素的能力。

3.4 转基因鲟龙鱼的预期体重

在生长条件相同的情况下，如果转LGH基因鲟龙鱼的体重是对照鱼体重的1.5倍以上，说明外源生长激素基因在鲟龙鱼体内稳定表达，具有显著的促进生长作用；鲟龙鱼血清中的生长激素基因浓度可以反映转LGH外源基因在鲟龙鱼中的表达水平。

转LGH基因技术快速发展的同时也带来一些需要解决的问题，如受精卵体外操作成活率低，外源基因的整合位点及拷贝数不能控制，表达不能和预期结果相符，外源基因插入容易缺失突变至不育等[2]。只有在认真研究这些问题的基础上，才能自如地导入目的基因，希望该设想对转基因鲟龙鱼的研究能起到推动作用。

参考文献

[1] 朱文进，张美俊.动物转基因技术的研究领域及其对社会的影响[J]动物科学，2005，4：8-10.

[2] 张希春.转基因鱼的食用安全性评价及其分子生物学基础[J].卫生研究，2004，（02）.

作者简介：李亚芹，硕士，长春医学高等专科学校，副教授，研究方向：基因工程。