不同产区晒红烟TSNAs含量分析

丁睿，王乃顺，于存峰，马雁军，王丽丽，夏冰冰，王允白

1.中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101；2.中国农业科学院研究生院，北京 100081；3.山东中烟有限责任公司，济南 250100 4. 上海烟草( 集团) 公司技术中心北京工作站，北京 101121；5.山东临沂烟草有限公司，临沂 276000

不同产区晒红烟TSNAs含量分析

丁睿1、2，王乃顺3，于存峰3，马雁军4，王丽丽5，夏冰冰1、2，王允白1

1.中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101；2.中国农业科学院研究生院，北京 100081；3.山东中烟有限责任公司，济南 250100 4. 上海烟草( 集团) 公司技术中心北京工作站，北京 101121；5.山东临沂烟草有限公司，临沂 276000

采用高效液相色谱—串联质谱法（HPLC-MS-MS）对我国7个地方晒红烟主产区共77个样品的烟叶TSNA进行了检测和分析，结果表明：我国不同产区晒红烟烟叶TSNA含量存在显著差异，烟叶总TSNA含量分布在0.463～66.236 μg/g之间，不同产区从高到低顺序为：浙江＞江西＞山东＞四川＞吉林＞湖南＞贵州。相关分析显示烟叶中的TSNAs与生物碱存在显著或极显著相关关系。

晒红烟；烟草特有亚硝胺；差异

烟草特有亚硝胺(tobacco-specific nitrosamine，TSNA)是烟草生物碱和亚硝酸盐发生亚硝化反应生成的化合物，在烟叶和烟气中都有存在。现已证实的有8种烟草特有的亚硝胺，其中最主要的有4种: N-亚硝基降烟碱(NNN)，4-(N-甲基-亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮 (NNK)，N-亚硝基假木贼碱(NAB)和N-亚硝基新烟碱(NAT)[1]。动物试验表明，NNK和NNN具有一定的致癌性和致突变性[2-4]，因此认为，TSNA的含量和组成直接影响烟草制品的安全性。

研究证明，不同类型烟草的TSNA含量有显著性差异。史宏志等对来自不同产地的烤烟、白肋烟和香料烟烟叶进行分析后发现，白肋烟的烟叶中TSNA含量最高，平均为10.25 μg/g；香料烟次之，平均为0.432 μg/g；烤烟一般为0.156～0.42 μg/g，远低于白肋烟和部分香料烟[5]。白肋烟等较高TSNA含量的晾晒烟的使用,致使混合型卷烟的TSNA含量提高，影响了混合型卷烟的安全性。史宏志等对我国的9种烤烟型卷烟和5种混合型卷烟的TSNA含量进行分析后发现，烤烟型卷烟的TSNA含量平均为0.197 μg/g；混合型卷烟的TSNA含量平均为3.302 μg/g[5]。

晒红烟具有独特的吸味和香气特征，可以作为混合型卷烟的原料应用到卷烟之中，在卷烟叶组配方中可用来增香和改进吸味[6]。研究表明，中式低焦油卷烟配方中加入一定比例的晒红烟能显著提高烟气的香气量、烟气浓度和吸食满足感[7]。我国的晒红烟资源非常丰富且分布广泛，是发展混合型卷烟的宝贵资源。但目前针对我国晒红烟的研究比较少，对于不同产地晒红烟的TSNA含量的研究更是鲜有报道。本文研究了不同产区、不同品种烟叶TSNA的含量，对于客观评价其烟叶的产品质量、安全性及卷烟配方可用性，对于我国卷烟工业合理使用晒红烟开发中式混合型卷烟，提高卷烟安全性具有借鉴意义。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

1.1.1 材料

2012年在贵州、湖南、吉林、四川、山东、江西和浙江7个晒红烟产区共采集具有代表性的地方晒红烟中部叶样品77个。烟叶抽去主脉，60℃烘干后磨碎，过40目筛，用于烟叶成分检测。

1.1.2 试剂

标准品：NNK、NNN、NAB、NAT，内标：NNN-d4、NNK-d4、NAB-d4和 NAT-d4，纯度＞98%；超纯水，电导率≥18.2MΩ·cm；甲醇，色谱纯；乙腈，色谱纯；甲酸铵，纯度≥99 %；甲酸、乙酸铵，色谱纯。

1.1.3 仪器

使用仪器为美国Agilent公司生产的Agilent 1200高效液相色谱议，美国应用生物系统公司生产的API 5500型三重四极杆质谱议，美国Millipore公司生产的Milli-Q 50 超纯水仪，德国Sartorius公司生产的CP2245 分析天平，上海安谱科学仪器有限公司生产的13 mm × 0.22 μm水相针式过滤器，英国Filtrona公司450型20通道吸烟机，常州国华电器有限公司生产的HY-8调速振荡器。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理

准确称取1.00 g样品置于50 mL锥形瓶中，然后加入0.1 mL 2000 ng/mL的内标溶液和30 mL 100 mmol/L的乙酸铵溶液，用振荡器以130 rpm振荡30 min，然后用0. 22 μm水相针式过滤器过滤到2 mL的色谱瓶中进行LC-MS/MS分析。参照张杰等[8]方法。

1.2.2 色谱条件

色谱柱：Poroshell 120 SB-C18(4.6×150 mm, 2.7 μm，美国 Agilent 公司)；柱温：50 ℃；进样量:5 μL；流动相：A：水(含0.1 %乙酸，体积分数)，B：甲醇(含0.1 %乙酸，体积分数)；洗脱方式：等度洗脱，流速 0.30 mL/min；预平衡时间：5 min。参照张杰等[8]方法。

1.2.3 质谱条件

离子源:电喷雾离子源(ESI)；扫描模式：正离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)；离子喷雾电压(Ionspray Voltage，IS)：5000 V；雾化气流速(GS1，N2)：3.8 kg/cm2；辅助加热气流速(GS2，N2)：3.8 kg/cm2；气帘气流速 (Curtain Gas，CUR，N2)：1.0 kg/cm2；碰撞气流速(Collision Gas，CAD，N2)：0.4 kg/cm2；离子源温度(TEM)：550 ℃；驻留时间(Dwell Time)：50 ms；入口电压 (Entrance Potential，EP)：10 V；出口电压(Collision Cell Exit Potential，CXP)：9 V。参照张杰等[8]方法。

1.2.4 数据处理

统计分析主要运用Excel2010对原始数据进行标准化处理，运用SAS9.1软件进行方差分析、简单相关、偏相关分析和逐步回归分析。

2 结果与分析

2.1 不同产区晒红烟烟叶TSNA变异及含量差异分析

对所取样品烟叶的TSNA含量进行测定和对各产区样品烟叶TSNA含量进行方差分析，统计结果见表1。由表1可知，不同产区晒红烟烟叶TSNA含量存在显著差异。总TSNA含量分布在0.463～66.236 μg/g之间，其中贵州产区样品的TSNAs含量最低，均值为1.715 μg/g，浙江产区样品的TSNAs含量最高，均值达到42.848 μg/g，是贵州产区的25倍。四川、吉林、湖南和贵州产区间差异不显著，而与其他产区差异极显著；浙江、江西、山东产区均与其他产区有极显著差异。从提高卷烟安全性角度考虑，贵州、湖南和吉林产区的晒红烟样品因烟叶中的TSNA含量较低，较适宜作混合型卷烟的原料。

从单一TSNA成分来看，它们在各产区含量的差别与TSNAs含量差别基本一致。NNN含量以浙江

产区最高，贵州产区最低。四川、吉林、湖南和贵州产区间差异不显著，而与其他产区差异极显著；浙江、江西、山东产区均与其他产区有极显著差异。NAT含量同样以浙江产区最高，贵州产区最低。四川、吉林、湖南和贵州产区间差异不显著；江西和山东产区间差异不显著；浙江产区与其它产区差异极显著。NNK含量以江西产区最高，贵州产区最低；NAB含量以江西产区最高，吉林产区最低。NNK与NAB的差异分析相同：四川、吉林、湖南、贵州和山东产区间差异不显著；江西和浙江产区均与其他产区有极显著差异。

从TSNA组成来看，除江西和湖南两产区，NNN所占TSNAs的比例最高外，其他5个产区中，均是NAT所占总TSNA的比例最高。在所有产区中，NAT与NNN含量之和占TSNAs的比例为85.868%～95.487%，是TSNA中的主要成分。

表1 不同产区晒红烟烟叶中TSNA含量及差异分析Tab. 1 Analysis of TSNA content and differences in red sun-cured tobacco from different regions

2.2 不同产区晒红烟烟叶生物碱含量分析

为探索晒红烟TSNA与烟叶生物碱的相关性，对所取的77个晒红烟样品烟叶的生物碱含量进行了测定，统计结果见表2。由表2可知，晒红烟生物碱含量的标准偏差均较小，说明样品的生物碱含量比较稳定。总生物碱含量分布在18.698～73.746 mg/g之间。其中浙江产区样品的总生物碱含量最高，均值达到67.108 mg/g，四川产区样品的总生物碱含量最低，均值为34.609 mg/g。不同产区晒红烟烟叶总生物碱含量均值从高到低顺序为：浙江＞山东＞湖南＞吉林＞江西＞贵州＞四川。

表2 不同产区晒红烟烟叶生物碱含量分析Tab. 2 Analysis of alkaloid content in red sun-cured tobacco from different regions

2.3 烟叶TSNA与烟叶生物碱的相关分析

为了明确烟叶TSNA与烟叶生物碱间的关系，从而探究TSNA的来源和降低TSNA的方法，本研究通过简单相关分析、偏相关分析和逐步回归分析对晒红烟样品的烟叶TSNA与烟叶生物碱进行分析，结果见表3所示。

由简单相关系数可知TSNAs与烟碱、假木贼碱、总生物碱呈极显著正相关，与降烟碱呈显著正相关。由偏相关系数可知：TSNAs与新烟草碱呈极显著负相关，与假木贼碱呈极显著正相关。以上结果与简单相关分析结果不完全一致，分析结果的差异说明新烟草碱、假木贼碱对TSNA的直接作用较大，而烟碱、降烟碱对TSNA的间接作用较大。

表3 烟叶TSNA与生物碱的相关系数Tab. 3 Correlation coefficients of tobacco TSNA and alkaloids

为进一步探明烟叶TSNA与烟叶生物碱的相关性，以烟叶中TSNA组分：NAT(Y1)、NNN(Y2)、NNK(Y3)、NAB(Y4)、TSNAs(Y5)为因变量，以烟碱(X1)、降烟碱(X2)、新烟草碱(X3)、假木贼碱(X4)、总生物碱(X5)为自变量，做逐步回归，并对回归模型进行显著性检验，均达到极显著水平，建立的逐步回归方程如下：

Y1= 3.814 -3.833X3+53.115X4（R2=0.5768）

Y2= -17.640 -2.792X3+36.592X4（R2=0.6318）

Y3= -1.612 -0.405X2（R2=0.5270）

Y4= -0.932 -0.278X3+2.189X4（R2=0.6761）

Y5= -2.841+0.267X1-7.927X3+55.674X4（R2=0.6353）

Y2、Y4、Y5模型的决定系数R2均大于0.63，说明应用当前模型能解释63%以上的因变量变化，由此可见，该拟合方程具有较大的参考价值。Y1、Y3模型的决定系数R2均大于0.52，说明拟合方程有一定的参考价值。由此可知：

烟叶NAT与新烟草碱、假木贼碱有（极）显著相关；NNN与新烟草碱、假木贼碱有（极）显著相关；NNK与降烟碱有（极）显著相关；NAB与新烟草碱、假木贼碱有（极）显著相关；TSNAs与烟碱、新烟草碱、假木贼碱有（极）显著相关。

3 讨论与结论

不同产区晒红烟烟叶TSNA含量从低到高顺序为贵州＜湖南、吉林和四川＜山东和江西＜浙江。不同产区晒红烟烟叶TSNA含量存在显著差异，这可能是品种的遗传特性和独特的生态条件与不同的栽培调制方式等作用的结果[9-11]。进一步开展生态条件、品种、栽培条件与调制方式等对TSNA含量的影响的研究，筛选不同产区的主栽低TSNA烟叶品种、规范栽培条件和调制技术，降低晒红烟烟叶的TSNA，提高卷烟原料的安全性应是下一步研究的重点。

相关和回归分析显示烟叶NAT、NNN、NAB、TSNAs均与新烟草碱呈直接负相关，与假木贼碱呈直接正相关；烟叶NNK与降烟碱呈间接接负相关；TSNAs与烟碱呈间接正相关。这与TSNAs与其前体物质间的相互转化有关[15]。

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Determination of TSNAs in red sun-cured tobacco leaves from different growing areas

DING Rui1，2，WANG Naishun3，YU Cunfeng3，MA Yanjun4，WANG Lili5，XIA Bingbing1，2，WANG Yunbai1
1. Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, China;2. Graduate School, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;3. China Tobacco Shandong Industrial CO., Ltd, Jinan 250100, China;4. Beijing Technology Centre, Shanghai Tobacco Co. Ltd.，Beijing 101121，China;5. Shandong Linyi Tobacco Co., Ltd, Linyi, 276000, China

Contents of TSNAs in 77 red sun-cured tobacco samples from 7 growing areas were determined by HPLC-MS-MS. Results showed that there were significant differences among sample leaves. Total TSNAs contents ranged from 0.463 to 66.236 μg/g. Leaves from Zhejiang has the highest TSNAs level, followed by those from Jiangxi, Shandong, Jilin, Hunan, Guizhou and Sichuan. Correlations found between TSNAs and tobacco alkaloids were significant or highly significant.

red sun-cured tobacco; tobacco-specific nitrosamine; difference

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.04.004

TS411 文献标志码：A 文章编号：1004-5708（2014）04-0018-05

上海烟草集团北京卷烟厂资助项目(No. JZ12004)

丁睿（1987—），硕士研究生，研究方向为烟草化学，Email：dingrui998877@163.com

王允白（1964—），硕士，研究员，研究方向为烟草化学与品质，Email：ycswyb@163.com

2014-02-17