合欢皮总皂苷提取工艺优化

王巧文，钱泽秀，孙红祥

(浙江大学动物科学学院，杭州310058)

合欢皮(Cortex Albizziae)为豆科植物合欢(Albizziajulibrissin Durazz.)的干燥茎皮，其味甘、性平，具安神解郁、活血消肿功，主治心神不安、躁动不安、跌打损伤和怆惶疗毒等症［1］。合欢皮含有三萜皂苷、生物碱、黄酮类、木脂素、多糖等多类化学成分，其中三萜皂苷是合欢皮的主要有效成分，具有广泛的生理活性和药理作用，如抗抑郁、抗生育、抗氧化、抗糖尿病、抗菌、保肝、抗血管生成、抗肿瘤、抗菌和免疫调节等［2-4］。近年来，研究发现合欢皮总皂苷对禽流感–新城疫重组二联活疫苗［5-6］、猪伪狂犬病弱毒疫苗［7］、猪 O 型口蹄疫灭活疫苗［8］等商品疫苗均具有显著的佐剂作用，并在靶动物上得到了证实。为了建立科学、合理的提取工艺，进一步促进合欢皮总皂苷作为疫苗佐剂新兽药的研究与开发，试验根据合欢皮中皂苷的理化性质，建立了以齐墩果酸为对照品，分光光度法测定含量的方法，并采用单因素试验和正交设计方法，以总皂苷收率为指标，对醇提工艺乙醇浓度、乙醇用量、提取时间和提取次数进行考察，优选合欢皮总皂苷的提取工艺。

1 仪器与试剂

1.1 仪器与设备 TU-1800PC型紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);Sartorious 1700型电子天平(W-Germany);DK-S26型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司);W501型恒温水浴锅(上海申生科技有限公司);R502B型旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司);SHB-Ш循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);DLSB低温冷却液循环泵(郑州长城科工贸有限公司)。

1.2 试剂 合欢皮丝，浙江省景岳堂药业有限公司，批号:13073103;齐墩果酸对照品，中国食品药品检定研究院 (110709-200304);试验用水为超纯水;所用试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 总皂苷含量测定

2.1.1 对照品溶液制备 精密称取干燥至恒重的齐墩果酸对照品11.0 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。取10 mL于50 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，得浓度为0.044 mg/mL的齐墩果酸对照品溶液。

2.1.2 样品溶液制备 准确称取10 g合欢皮丝，置于500 mL圆底烧瓶中，按实验设置的处理条件提取。提取液滤过，合并滤液，减压回收乙醇、以超纯水调整体积至50 mL。取20 mL经等体积乙醚萃取3次脱脂后，以等体积水饱和正丁醇萃取3次，合并正丁醇萃取液，减压回收溶剂、浓缩至干，加甲醇溶解，转移至10 mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，精密吸取0.5 mL于10 mL容量瓶并定容，混匀，即得样品溶液。

2.1.3 检测波长选择 精密吸取对照品溶液2.0 mL和样品溶液0.5 mL，分别置于10 mL刻度螺纹试管中，70℃恒温水浴加热蒸干。精密加入5%香草醛–冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.8 mL，密封，60℃水浴反应15 min，冰浴冷却10 min，再精密加入5 mL冰醋酸，摇匀。以空白试剂做参比，用TU-1800型紫外可见分光光度计，于400～700 nm波长范围内扫描。结果齐墩果酸和样品溶液均在550 nm波长处有最大吸收，故选择550 nm为测定波长。

2.1.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 至10 mL 刻度试管中，按“2.1.3”项下方法操作，以空白试剂做参比，按紫外分光光度法于550 nm波长处测定吸光度［1］。以吸光度A为纵坐标、齐墩果酸浓度C(μg·mL-1)为横坐标绘制标准曲线，得回归方程为:A＝0.0418C+0.0022(r＝0.9991)。可见，齐墩果酸在每mL含3.67～18.33 μg的浓度范围内，其浓度与吸光度呈良好的线性关系。

2.1.5 精密度试验 精密吸取样品溶液5份，按“2.1.3”项下方法操作，于550 nm波长处测定吸光度，RSD为0.10%(n＝5)，表明该方法精密度良好。

2.1.6 样品溶液稳定性 精密吸取样品溶液0.5 mL，按“2.1.3”项下方法处理，分别显色后0、5、10、15、20、25、30 min，于 550 nm 波长处测定吸光度。结果吸光度基本一致，RSD为0.20%(n＝6)，说明样品溶液显色后30 min内基本稳定。

2.1.7 重复性试验 取同一批药材6份，分别按“样品溶液制备”项下方法制备样品溶液，“2.1.3”项下方法测定吸光度，计算总皂苷含量，RSD为0.92%(n＝6)，说明重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验 取已知含量的同一批药材6份，加入不同量的齐墩果酸标准品，按“样品溶液制备”项下制备样品溶液，“2.1.3”项下方法测定吸光度，计算加样回收率。结果平均回收率为100.33，RSD为1.50%(n＝6)。可见，本方法能准确地测定合欢皮总皂苷含量。

2.2 单因素试验

2.2.1 乙醇浓度考察 准确称取10 g合欢皮丝，置于500 mL圆底烧瓶。恒定回流时间2 h、提取次数3次、提取溶剂用量12倍的条件下，分别用质量浓度50%、60%、70%和80%乙醇进行提取。按“2.1”项下方法测定总皂苷含量，计算总皂苷收率(mg/g)，结果见图1。随着乙醇浓度的增加，合欢皮总皂苷收率呈先增大后减小。因此，选择60%、70%、80%作为正交试验中乙醇浓度的3个水平。

2.2.2 乙醇用量考察 准确称取10 g合欢皮丝，置于500 mL圆底烧瓶。恒定回流时间2 h、提取次数3次、乙醇浓度70%的条件下，分别以药材量的6、8、10和12倍的乙醇进行提取。按“2.1”项下方法测定总皂苷含量，计算总皂苷收率(mg/g)，结果见图2。随着乙醇用量倍数的增加，总皂苷收率呈增加的趋势。因此，选择10、12、14倍作为正交试验中乙醇用量的3个水平。

图1 乙醇浓度对总皂苷收率的影响

图2 乙醇用量对总皂苷收率的影响

2.2.3 提取时间考察 准确称取10 g合欢皮丝，置于500 mL圆底烧瓶。恒定提取次数为3次、乙醇浓度70%、乙醇用量12倍的条件下，按每次提取时间分别为1、1.5、2、2.5 h 进行提取。按“2.1”项下方法测定总皂苷含量，计算总皂苷收率(mg/g)，结果见图3。2 h以内随着提取时间的增加，总皂苷收率呈增加的趋势，然而再延长提取时间差异不显著。因此，选择1、1.5和2 h作为正交试验中提取时间的3个水平。

2.2.4 提取次数考察 准确称取10 g合欢皮丝，置于500 mL圆底烧瓶。恒定回流时间为2 h、乙醇浓度70%、用量12倍的条件下，分别提取1次、2次、3次和4次。按“2.1”项下方法测定总皂苷含量，计算总皂苷收率(mg/g)，结果见图4，提取2次总皂苷收率显著高于1次，而2次、3次和4次之间总皂苷收率差异不显著。考虑到提取次数增多增加能耗，且2次基本提尽总皂苷。因此，在正交试验中固定提取次数为2次。

图3 提取时间对总皂苷收率的影响

图4 提取次数对总皂苷收率的影响

2.3 正交试验 根据单因素试验结果，选择影响合欢皮总皂苷收率因素中有统计学意义的水平做正交试验，采用 L9(34)正交试验表考察最佳工艺条件。正交试验因素水平见表1，试验结果见表2，方差分析见表3。

表1 正交试验因素水平表

表2 正交试验结果

表3 方差分析表

由表2极差R的数据分析可知:各因素的影响程度依次为B＞C＞A，即乙醇浓度＞提取时间＞乙醇用量。方差分析结果表明:B因素(乙醇浓度)对总皂苷收率有显著的影响(P＜0.01)，而A(乙醇用量)和C(提取时间)因素无显著性影响(P＞0.05)，以A3B2C3组合为佳，即乙醇用量14倍、乙醇浓度70%和提取时间2 h。

2.4 验证试验 取同一批药材，按上述确定最佳组合A3B2C3进行验证试验，结果见表4。A3B2C3工艺提取的总皂苷平均收率为8.617 mg·g-1，RSD＝0.115%(n＝3)。验证试验合欢皮总皂苷收率高于正交试验中各次的结果，说明该提取工艺合理、稳定、可行。

表4 验证试验结果

3 讨论

合欢皮中皂苷化合物种类多，化学结构复杂。目前分离得到的40多个化合物多为齐墩果烷型苷元与8～9个单糖分子以及二分子单萜烯酸(辛二烯酸衍生物)结合而成的一系列分子量在2000左右的三萜皂苷，包括单糖链、双糖链和三糖链［4］。目前文献报道的合欢皮总皂苷含量测定方法包括紫外分光光度法［9］和 HPLC法［10］。由于合欢皮中皂苷化合物的化学结构具有极大的相似性，分离纯化十分困难，目前尚无法定的合欢皮皂苷标准品。鉴于合欢皮中皂苷多为齐墩果烷型皂苷，上述二种定量方法均选用齐墩果酸为对照品。HPLC法需先通过酸水解将皂苷水解成苷元，然后检测齐墩果酸［10］。此法操作复杂繁琐，且合欢皮皂苷有多种苷元。紫外分光光度法所需设备及操作简单，易普及推广，灵敏度、准确度、重复性较高，应用范围广。因此，本文采用紫外分光光度法，对文献方法［9］作了改进，并进行了方法学考察。证实该方法操作简便、准确性高、稳定性强、重现性好，可行性良好。

有关合欢皮皂苷制备工艺，施建军等［10］曾以干粉得率、总苷含量、对人微血管内皮细胞的IC50值为指标，选取乙醇浓度、回流时间、提取次数、萃取次数四种因素，采用正交试验法优化了乙醇回流–水饱和正丁醇萃取工艺路线，得到了最优提取路线为用70%的乙醇，提取2次，每次回流3 h，最后用正丁醇萃取4次。该工艺使用的正丁醇沸点高，回收困难，不利于大生产。实验室前期筛选得到的具有佐剂活性的合欢皮总皂苷采用适于工业化大生产的乙醇回流–大孔树脂洗脱工艺路线制备。试验选择对合欢皮皂苷提取影响较大的乙醇浓度、乙醇用量、提取时间、提取次数四个关键因素进行单因素试验，确定正交试验的因素和水平设置。在此基础上，通过正交试验法优选合欢皮总皂苷的最佳提取工艺条件，即乙醇用量14倍、浓度乙醇70%、提取2次、每次2 h，得到的合欢皮总皂苷收率为 8.617 mg·g-1。

该提取工艺操作简单、稳定、可行，为合欢皮总皂苷后续的纯化、以及合欢皮总皂苷作为疫苗佐剂新兽药的研究与开发奠定了基础。

［1］中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典 二○一○年版［S］.

［2］侯永坤，番雨利，冷艳华.合欢属植物中三萜皂苷及药理活性研究进展［J］.中国医药导报，2010，7(29):7-8.

［3］Kokila K，Priyadharshini S D，Sujatha V.Phytopharmacological properties of Albizia species:a review ［J］.Int J Pharm Pharm Sci，2013(Supp 3)，5:70-73.

［4］Han LF，Pan GX，Wang YF，et al.Rapid profiling and identification of triterpenoid saponins in crude extracts from Albizia julibrissin Durazz.by ultra high-performance liquid chromatography coupled with electrospray ionization quadrupole time-offlight tandem mass spectrometry ［J］.J Pharm Biomed Anal，2011，55:996-1009.

［5］何树旺.合欢皮皂苷佐剂活性的研究［D］.杭州:浙江大学，2009.

［6］李富强.合欢皮皂苷佐剂的免疫学活性研究［D］.杭州:浙江大学，2010.

［7］施明华.合欢皮皂苷佐剂活性部位对两种兽用疫苗的佐剂作用［D］.杭州:浙江大学，2012.

［8］张 娟.合欢皮皂苷对猪O型口蹄疫灭活疫苗的佐剂作用［D］.杭州:浙江大学，2014.

［9］冯 磊，陈 爽，邱丽颖，等.紫外分光光度法测定合欢皮总皂苷的含量［J］.华西药学杂志，2009，24(6):642-644.

［10］施建军，谭 莹，杜 斌，等.HPLC法测定合欢皮抗新生血管有效部位中的总皂苷［J］.中成药，2012，34(10):2025-2028.

［11］施建军.合欢皮总皂苷提取工艺路线的优化和质量标准的初定［D］.无锡:江南大学，2012.