野菊花总黄酮清除自由基的活性研究

曹小燕++杨海涛

摘要：采用邻二氮菲-Fe2+氧化法、邻苯三酚自氧化和ABTS法，分别测定野菊花总黄酮对羟自由基

关键词：野菊花；总黄酮；自由基；清除率；维生素C；柠檬酸

中图分类号： R284.1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）10-0307-03

收稿日期：2014-01-02

基金项目：陕西省教育厅专项科研计划（编号：2013JK0680）；陕西理工学院校级人才启动项目（编号：SLGQD13-1）。

作者简介：曹小燕（1982—），女，河南开封人，博士，讲师，主要从事有机化学研究。E-mail：ruoshuizhihan@163.com。野菊花（Chrysanthermum indicum L.）为菊科多年生草本植物菊花的头状花序，民间在秋季开花时采后凉干或晒干泡茶饮用，但更多的是药用。野菊花富含酚酸、黄酮、萜类及挥发油等有效成分，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒等活性[1]。经调研发现，野菊花的主要活性成分为黄酮类化合物和绿原酸，黄酮类化合物具有抗癌、抑菌、抗氧化、抗衰老等作用[2]。野菊花黄酮的主要成分是蒙花苷和木犀草素，其中蒙花苷别称野菊花黄酮苷，能有效抑制金黄色葡萄球菌和乙型溶血链球菌，并具有抑制磷酸二酯酶、醛糖还原酶和保肝的作用，对慢性气管炎也有一定疗效[3-4]；木犀草素具有抑菌活性，对黄嘌呤氧化酶具有较强的抑制活性，对cAMP-磷酸二酯酶的IC50值为79 μmol/L[5]。野菊花多糖具有清除活性氧自由基的作用[6]；其水提取物能够有效地抑制红细胞溶血，还可以提高体内抗氧化酶的活性[7]；其挥发油还能够有效地清除DPPH·自由基[8-9]。

近年来，世界上掀起了植物药开发的热潮，植物药以其天然、低毒的特点备受青睐，其中黄酮类化合物以其广谱的药理作用引人瞩目。本试验以乙醇为溶剂，研究野菊花总黄酮含量及自由基清除活性，为野菊花的生物活性研究及其开发利用提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料与仪器

野菊花采于陕西省汉中市褒河镇；芸香苷标准品（自制）；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、水杨酸、过氧化氢、硫酸亚铁、无水乙醇、柠檬酸、维生素C 、碘化钾、冰醋酸、三氯甲烷、淀粉、铁氰化钾、三氯化铁、三氯乙酸、三羟甲基氨基甲烷、邻苯三酚，均为市售分析纯。

AL204-IC型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；722E分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；HHS-1数显恒温水浴锅（江苏省金坛市金祥龙电子有限公司）；101A-1电热鼓风干燥箱（中国重庆银河试验仪器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（河南省巩义市英峪予华仪器厂）；CL-2型加热磁力搅拌器（河南省巩义市英峪予华仪器厂）；TGL-16C型台式离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2试验方法

1.2.1野菊花中总黄酮的提取取新鲜野菊花，烘干，粉碎。称取野菊花粉末约5 g，加80 mL 95%乙醇回流提取2 h，抽滤。滤渣再加80 mL 95%乙醇，回流提取2 h，抽滤，合并2次滤液，减压回收乙醇至滤液仅剩25 mL左右为止，放置于 250 mL 容量瓶中，用60%乙醇稀释至刻度，得样品液[10-11]。

1.2.2标准曲线的绘制精确称取干燥至恒重的芸香苷标准品20.0 mg，加乙醇溶解并定容至50 mL，配成0.4 mg/mL芸香苷标准溶液。准确吸取标准品溶液0.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00、9.00 mL，分别加乙醇补至 10.00 mL，加5%亚硝酸钠溶液1.5 mL，摇匀，静置6 min，加10%硝酸铝溶液1.5 mL，摇匀，静置6 min，加4%氢氧化钠溶液 15 mL，用乙醇稀释至刻度，摇匀，放置15 min，在波长 510 nm 处测定吸光度，以芸香苷浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度（D）为纵坐标，绘制标准曲线[12]。

1.2.3野菊花总黄酮含量的测定精确吸取样品液 0.50 mL，置于10 mL容量瓶中，根据标准曲线的制备方法测定吸光度D，线性回归计算野菊花中总黄酮的含量C[13]。

2.6野菊花总黄酮还原能力的测定结果

测定野菊花的还原力，实质上是检验野菊花是否为良好的电子供应者，进一步证实野菊花为良好的自由基清除剂。抗氧化剂是通过自身的还原作用给出电子，从而清除自由基，还原力越强，自由基清除活性越强，抗氧化性越强，因此可通过测定还原力来说明其抗氧化活性的强弱。本试验中利用野菊花总黄酮被铁氰化钾氧化来表征还原力，700 nm处的吸光度越大，还原力越强。由图4可知，随着样品浓度升高，野菊花和维生素C于700 nm处的吸光度逐渐增大，并且存在良好的线性关系，表明其还原能力逐渐增强；野菊花总体还原能力优越于常规抗氧化剂维生素C，进一步解释了野菊花为什么具有较强的自由基清除活性，也进一步证实了野菊花是良好的自由基清除剂；柠檬酸总体还原能力几乎为0，证实其为什么具有较弱的自由基清除活性。

3结论

本研究通过乙醇提取、芸香苷标定，确定野菊花提取液的总黄酮含量为0.25 mg/mL。野菊花具有较强的还原能力，对·OH、O-2· 和ABTS+·都具有良好的清除活性，清除效率优于常规抗氧化剂维生素C和柠檬酸，清除·OH、O-2· 和ABTS+·的EC50值分别为0.016、0.012 mg/mL和 6.95 μg/mL。野菊花资源丰富，分布广泛，本研究证实其为良好的自由基清除剂，为野菊花的生物活性研究和资源开发提供了理论依据。

参考文献：

[1]郭美兰，敬应春，蔡国琴. RP-HPLC同时测定野菊花中绿原酸、木犀草苷和蒙花苷的含量[J]. 中国现代中药，2012，14（4）：10-13.

[2]赵秀玲. 野菊花的功效因子、保健作用及其开发利用的研究进展[J]. 食品工业科技，2012，33（6）：429-431，434.

[3]陈惠芳. 植物活性成分词典[M]. 北京：中国医药科技出版社，2001：542.

[4]申海进，郭巧生，房海灵. 野菊花60%乙醇提取物的酚类成分组成及其清除自由基和防霉变能力分析[J]. 植物资源与环境学报，2010，19（1）：20-25.

[5]彭朋，程雪梅，刘力，等. 野菊花提取物的质量标准研究[J]. 中国药事，2010，24（7）：650-654.

[6]李贵荣. 野菊花多糖的提取及其对活性氧自由基的清除作用[J]. 中国公共卫生，2002，18（3）：269-270.

[7]严亦慈，娄小娥，蒋惠娣. 野菊花水提液抗氧化作用的实验研究[J]. 中国现代应用药学，1999，16（6）：16-18.

[8]褚福红，于新. 野菊花提取物清除自由基作用的研究[J]. 食品工业，2010（5）：1-3.

[9]申海进，郭巧生，房海灵.野菊花乙醚提取物的理化性质及抗氧化能力[J]. 食品科学，2012，33（15）：43-47.

[10]韩荣生，李鹏，李金辉. 野菊花中总黄酮的提取工艺研究[J]. 中国中医药咨讯，2011，3（6）：49-51.

[11]刁兴彬，蒋海强. 野菊花黄酮类抗氧化成分的提取工艺研究[J]. 湖北中医药大学学报，2010，12（6）：31-34.

[12]马燕妮，张清华，刘玉红，等. 桑叶黄酮与鬼针草黄酮组分配伍抗氧化协同作用研究[J]. 食品与药品，2013，15（3）：160-161.

[13]冯东辉，褚宏山，曹露露，等. 比色法测定野菊花中总黄酮含量[J]. 吉林医药学院学报，2009，30（5）：268-270.

[14]金鸣，蔡亚欣，李金荣，等. 邻二氮菲-Fe2+氧化法检测H2O2/Fe2+产生的羟自由基[J]. 生物化学与生物物理进展，1996，23（6）：553-555.

[15]韩少华，朱靖博，王妍妍. 邻苯三酚自氧化法测定抗氧化活性的方法研究[J]. 中国酿造，2009，6（6）：155-157.

[16]Re R，Pellegrini N，Proteggente A，et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay[J]. Free Radical Biology & Medicine，1999，26（9/10）：1231-1237.

[17]Oyaizu M. Studies on products of browning reaction-antioxidative activities of products of browning reaction prepared from glucosamine[J]. Japanese Journal of Nutrition，1986，40（44）：307-315.

[18]王建英，任引哲，王迎新.氧自由基与人体健康[J]. 化学世界，2006，47（1）：61-63.

[19]Buetler T M，Krauskopf A，Ruegg U T. Role of superoxide as a signaling molecule[J]. Physiology，2004，19（3）：120-123.

[20]Shen H M，Yang C F，Ding W X，et al. Superoxide radical-initiated apoptotic signalling pathway in selenite-treated HepG2 cells：mitochondria serve as the main target[J]. Free Radical Biology & Medicine，2001，30（1）：9-21.

[2]赵秀玲. 野菊花的功效因子、保健作用及其开发利用的研究进展[J]. 食品工业科技，2012，33（6）：429-431，434.

[3]陈惠芳. 植物活性成分词典[M]. 北京：中国医药科技出版社，2001：542.

[4]申海进，郭巧生，房海灵. 野菊花60%乙醇提取物的酚类成分组成及其清除自由基和防霉变能力分析[J]. 植物资源与环境学报，2010，19（1）：20-25.

[5]彭朋，程雪梅，刘力，等. 野菊花提取物的质量标准研究[J]. 中国药事，2010，24（7）：650-654.

[6]李贵荣. 野菊花多糖的提取及其对活性氧自由基的清除作用[J]. 中国公共卫生，2002，18（3）：269-270.

[7]严亦慈，娄小娥，蒋惠娣. 野菊花水提液抗氧化作用的实验研究[J]. 中国现代应用药学，1999，16（6）：16-18.

[8]褚福红，于新. 野菊花提取物清除自由基作用的研究[J]. 食品工业，2010（5）：1-3.

[9]申海进，郭巧生，房海灵.野菊花乙醚提取物的理化性质及抗氧化能力[J]. 食品科学，2012，33（15）：43-47.

[10]韩荣生，李鹏，李金辉. 野菊花中总黄酮的提取工艺研究[J]. 中国中医药咨讯，2011，3（6）：49-51.

[11]刁兴彬，蒋海强. 野菊花黄酮类抗氧化成分的提取工艺研究[J]. 湖北中医药大学学报，2010，12（6）：31-34.

[12]马燕妮，张清华，刘玉红，等. 桑叶黄酮与鬼针草黄酮组分配伍抗氧化协同作用研究[J]. 食品与药品，2013，15（3）：160-161.

[13]冯东辉，褚宏山，曹露露，等. 比色法测定野菊花中总黄酮含量[J]. 吉林医药学院学报，2009，30（5）：268-270.

[14]金鸣，蔡亚欣，李金荣，等. 邻二氮菲-Fe2+氧化法检测H2O2/Fe2+产生的羟自由基[J]. 生物化学与生物物理进展，1996，23（6）：553-555.

[15]韩少华，朱靖博，王妍妍. 邻苯三酚自氧化法测定抗氧化活性的方法研究[J]. 中国酿造，2009，6（6）：155-157.

[16]Re R，Pellegrini N，Proteggente A，et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay[J]. Free Radical Biology & Medicine，1999，26（9/10）：1231-1237.

[17]Oyaizu M. Studies on products of browning reaction-antioxidative activities of products of browning reaction prepared from glucosamine[J]. Japanese Journal of Nutrition，1986，40（44）：307-315.

[18]王建英，任引哲，王迎新.氧自由基与人体健康[J]. 化学世界，2006，47（1）：61-63.

[19]Buetler T M，Krauskopf A，Ruegg U T. Role of superoxide as a signaling molecule[J]. Physiology，2004，19（3）：120-123.

[20]Shen H M，Yang C F，Ding W X，et al. Superoxide radical-initiated apoptotic signalling pathway in selenite-treated HepG2 cells：mitochondria serve as the main target[J]. Free Radical Biology & Medicine，2001，30（1）：9-21.

[2]赵秀玲. 野菊花的功效因子、保健作用及其开发利用的研究进展[J]. 食品工业科技，2012，33（6）：429-431，434.

[3]陈惠芳. 植物活性成分词典[M]. 北京：中国医药科技出版社，2001：542.

[4]申海进，郭巧生，房海灵. 野菊花60%乙醇提取物的酚类成分组成及其清除自由基和防霉变能力分析[J]. 植物资源与环境学报，2010，19（1）：20-25.

[5]彭朋，程雪梅，刘力，等. 野菊花提取物的质量标准研究[J]. 中国药事，2010，24（7）：650-654.

[6]李贵荣. 野菊花多糖的提取及其对活性氧自由基的清除作用[J]. 中国公共卫生，2002，18（3）：269-270.

[7]严亦慈，娄小娥，蒋惠娣. 野菊花水提液抗氧化作用的实验研究[J]. 中国现代应用药学，1999，16（6）：16-18.

[8]褚福红，于新. 野菊花提取物清除自由基作用的研究[J]. 食品工业，2010（5）：1-3.

[9]申海进，郭巧生，房海灵.野菊花乙醚提取物的理化性质及抗氧化能力[J]. 食品科学，2012，33（15）：43-47.

[10]韩荣生，李鹏，李金辉. 野菊花中总黄酮的提取工艺研究[J]. 中国中医药咨讯，2011，3（6）：49-51.

[11]刁兴彬，蒋海强. 野菊花黄酮类抗氧化成分的提取工艺研究[J]. 湖北中医药大学学报，2010，12（6）：31-34.

[12]马燕妮，张清华，刘玉红，等. 桑叶黄酮与鬼针草黄酮组分配伍抗氧化协同作用研究[J]. 食品与药品，2013，15（3）：160-161.

[13]冯东辉，褚宏山，曹露露，等. 比色法测定野菊花中总黄酮含量[J]. 吉林医药学院学报，2009，30（5）：268-270.

[14]金鸣，蔡亚欣，李金荣，等. 邻二氮菲-Fe2+氧化法检测H2O2/Fe2+产生的羟自由基[J]. 生物化学与生物物理进展，1996，23（6）：553-555.

[15]韩少华，朱靖博，王妍妍. 邻苯三酚自氧化法测定抗氧化活性的方法研究[J]. 中国酿造，2009，6（6）：155-157.

[16]Re R，Pellegrini N，Proteggente A，et al. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay[J]. Free Radical Biology & Medicine，1999，26（9/10）：1231-1237.

[17]Oyaizu M. Studies on products of browning reaction-antioxidative activities of products of browning reaction prepared from glucosamine[J]. Japanese Journal of Nutrition，1986，40（44）：307-315.

[18]王建英，任引哲，王迎新.氧自由基与人体健康[J]. 化学世界，2006，47（1）：61-63.

[19]Buetler T M，Krauskopf A，Ruegg U T. Role of superoxide as a signaling molecule[J]. Physiology，2004，19（3）：120-123.

[20]Shen H M，Yang C F，Ding W X，et al. Superoxide radical-initiated apoptotic signalling pathway in selenite-treated HepG2 cells：mitochondria serve as the main target[J]. Free Radical Biology & Medicine，2001，30（1）：9-21.