糖尿病肾病大鼠血浆差异表达蛋白的质谱分析

魏 敏，罗 仁，李璟怡，柳志伟，郑雪花

(1福建中医药大学中西医结合学院，福州 350122;2南方医科大学中医药学院;*通讯作者，E-mail:minwei99@163.com)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最严重的并发症之一，也是重要的死亡原因。近年来，DN已经成为导致终末期肾病(ESRD)的主要病因［1］，糖尿病肾病严重威胁人类健康。早期诊断、早期治疗对糖尿病肾病预后有重要的影响，因此寻找灵敏度特异度高的分子标志物，以达到早期诊断的目的具有重要的意义。蛋白组学技术的发展适用于寻找疾病的分子标记物研究［2，3］。本研究以糖尿病肾病(DN)大鼠模型为研究对象，应用双向电泳和质谱分析技术，初步筛选糖尿病肾病的差异表达蛋白质，为糖尿病肾病的发生机制研究提供线索。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选用SPF级Wistar雄性大鼠16只，体重200－280 g，鼠龄为3个月左右，南方医科大学动物实验中心供应，合格证:SCXK(粤)2011－0015。

1.1.2 主要仪器设备 等电聚焦仪(Protean IEF cell)、垂直电泳仪(ProteanⅡxi cell)及其配件均为Bio-Rad公司配套仪器;图像分析软件为PD-Quest;质谱仪用德国布鲁克(Bruker Dalton)Autoflex speed MALDI－TOF/TOF质谱仪。

1.1.3 试剂 干胶条 drystrip(24 cm，pH 4－7)购自Bio-Rad公司;IPG Buffer(pH 4－7)、水化盘、覆盖油购自GE公司;尿素、二硫苏糖醇(DTT)、3－［(3－胆酰胺丙基)－二乙铵］－丙磺酸(CHAPS)、十二烷基磺酸钠(SDS)、三羧基氨基甲烷(Tris碱)、丙烯酰胺(Arc)、甲叉双丙烯酰胺(Bis)、过硫酸铵(AP)、碘代乙酰胺(IAA)均为Sigma公司产品;硫脲为Fluka公司产品;硫代硫酸钠、无水碳酸钠、甲醛、硝酸银、乙醇、冰醋酸、醋酸钠、甘氨酸均为天津大茂化学试剂厂试剂，分析纯。所有缓冲液均用Milli-Q水配制。药物STA、血浆去高丰度蛋白试剂盒(ProteoPrep Blue Albumin and IgG Depletion Kit)购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立 大鼠适应性喂养1周后，禁食12 h，造模大鼠8只按65 mg/kg腹腔内一次性注射STZ。STZ临用前用枸橼酸钠缓冲液(0.1 mol/L，pH 4.5)配制，10 min内注射完，同时其余8只大鼠设为正常对照组。

1.2.2 血浆采集 处死DN模型组和正常对照组大鼠时腹主动脉取血，置 4℃ 3 000×g离心10 min，吸取上层血浆，EP管每100μl分装后，于－80℃保存备用。

1.2.3 双向电泳 取100μg蛋白样品与上样缓冲液(4%CHAPS，65 mmol/L DTT，1%IPG buffer，7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，1×BPB溴酚蓝)充分混合，总体积460μl，选用24 cm pH 4－7干胶条drystrip，参考文献［4］和仪器操作手册进行等电聚焦、SDS-PAGE凝胶电泳。

1.2.4 凝胶染色 电泳结束后，用塑料尺子将玻璃板翘起，轻轻取下胶条，并切角标记，放入染色盘中进行硝酸银染色。

1.2.5 图像扫描与分析 扫描仪获取染色后凝胶图像，用PD-Quest软件进行分析，选取表达量相差2倍以上为差异表达范围。

1.2.6 质谱鉴定及数据库检索 对选定的差异蛋白点进行胶内酶切及质谱鉴定。采用德国布鲁克(Bruker Dalton)Autoflex speedTMMALDI－TOF/TOF质谱分析，最优质量分辨率为1 500 Da，扫描质量范围为700－3 200 Da，收集信号，胰酶自切峰为内标校正质谱仪。质谱数据采用flexAnalysis(BrukerDalton)软件过滤基线峰、识别信号峰。利用BioTools(Bruker Dalton)软件搜索NCBInr数据库，寻找匹配的相关蛋白质，同时查询其功能，来明确鉴定的蛋白质为何种蛋白质。

2 结果

2.1 银染2-DE图谱及差异分析

正常对照组、模型组银染2-DE图谱见图1。将正常对照组、模型组凝胶图像用PD-Quest软件进行差异分析。与正常对照组相比，模型组血浆蛋白质银染双向凝胶电泳图谱中高表达的蛋白质斑点54个，低表达的蛋白质斑点19个。

2.2 质谱鉴定

结合软件分析及手工筛选，对2-DE获得的差异表达蛋白点选定16个挖点进行胶内酶切，再用MALDI-TOF/TOF质谱鉴定分析，经BioTools软件分析蛋白数据库NCBInr检索，成功鉴定出8种蛋白质(见表1)。血清对氧磷酶肽指纹图谱见图2、C反应蛋白肽指纹图谱见图3，横坐标表示肽段的质荷比，纵坐标表示肽段强度。

3 讨论

图1 银染双向电泳图谱Figure 1 Silver stained 2-DE map of proteins in normal control group and model group

表1 质谱鉴定的差异表达蛋白Table 1 Differentially expressed proteins identified by mass spectrometry

图2 血清对氧磷酶肽指纹图谱Figure 2 Peptide mass fingerprinting of serum paraoxonase

图3 C反应蛋白肽指纹图谱Figure 3 Peptide mass fingerprinting of C-reactive protein

糖尿病肾病的发病机制十分复杂，有多种因素共同作用［5］，包括肾脏血流动力学的改变、血糖过高导致代谢紊乱、高血压及血管活性物质代谢异常、细胞因子的作用、遗传及不良生活习惯的影响等。糖尿病肾病目前还很难做到早期发现和早期诊断，因此，找到与DN相关的特异性分子标志物已成为糖尿病肾病研究的热点问题之一。

蛋白组学由澳大利亚科学家Witzmann等［6］于1995年首次提出，是整合蛋白质提取、分离、质谱分析和生物信息学等技术，对组织和细胞中的蛋白质表达水平及功能进行高通量筛选和分析的一门学科。蛋白质组学技术在DN的发病机制研究中起着重要的作用，蛋白分离后的质谱技术主要用于蛋白质的鉴定。其基本原理是将样品分子或离子化后，根据离子间质量与电荷比(m/z)的差异来分离并确定分子量。本项目研究应用双向凝胶电泳技术成功分离蛋白，找出差异蛋白点，然后应用质谱技术MALDI－TOF/TOF对差异蛋白点进行鉴定。最终初步鉴定8种蛋白质可能与糖尿病肾病相关，分别是血清对氧磷酶(serum paraoxonase)、C反应蛋白(C-reactive protein)、甲状腺素运载蛋白(transthyretin)、Igκ链C区(Ig kappa chain C region)、纤维蛋白原α链(fibrinogen alpha chain)、丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor)、纤维蛋白原γ链(fibrinogen gamma chain)、结合珠蛋白(haptoglobin)。

血清对氧磷酶、C反应蛋白可能与糖尿病肾病的发病机制密切相关，有研究［7］表明血清对氧磷酶(serum paraoxonase，PON)是存在于高密度脂蛋白分子中的一种酶，可降低氧化脂质水平，部分水解脂质过氧化物，减少氧化型脂质积聚，具有抗氧化的作用，对2型糖尿病微血管病变的发生有重要的影响。C反应蛋白是机体非特异性炎症中的最敏感指标，其导致DN的发病机制可能为慢性炎症造成肾血管内皮细胞和系膜细胞的损害等多种途径使肾脏损伤;炎症反应可引发机体的氧化应激，产生脂质过氧化物如MDA，导致肾组织细胞膜的生理状态被破坏，血管通透性增加，造成肾损害［8］。我们的研究发现血清对氧磷酶、C反应蛋白等对糖尿病肾病有较好的诊断价值。

在后续的实验中，对鉴定出的差异蛋白功能深入研究，扩大样本量，将有助于阐明这些蛋白质在糖尿病肾病发生发展中的作用机制，进一步明确糖尿病肾病早期诊断的分子标志物，为早期治疗及改善预后奠定基础。

［1］Collins AJ，Kasiske B，Herzog C，etal.Excerpts from the United States Renal Data System 2004 annual data report:Atlas of endstage renal disease in the United States［J］.Am J Kidney Dis，2005，45(1):A5－A7.

［2］Deng L，Jia HL，Liu CW，etal.Analysis of differentially expressed proteins involved in hand，foot and mouth disease and normal sera［J］.Clin Microbiol Infect，2012，18(6):E18－196.

［3］Shi Y，Deng X，Zhan Q，etal.A Prospective proteomicbased study for identifying potential biomarkers for the diagnosis of cholangio carcinoma［J］.J Gastrointest Surg，2013，20(6):678－680.

［4］Gorg A，Obermaier C，Boguth G，etal.The current state of two－dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients［J］.E-lectrophoresis，2000，21(6):1037－1053.

［5］王海燕.肾脏病学［M］.北京:人民卫生出版社，2008:414－421.

［6］Witzmann F，Clack J，Fultz C，etal.Two-dimensional electrophoretic mapping of hepatic and renel stress proteins［J］.Electrophroesis，1995，16(3):451－459.

［7］Pinizzollo M，Castillo E，Fiaux M，etal.Paraoxonase 2 polymorphism are associated with diabetic nephropathy in typeⅡdiabetes［J］.Diabetologia，2001，1(44):104－107.

［8］Kashihara N，Hatuna Y，Kondeti VK，etal.Oxidative stress in diabetic nephropathy［J］.Curr Med Chem，2010，17(34):4256－4269.