适于基因芯片实验的小鼠脑组织RNA提取方法的改进

隋雷鸣，赵焕英，巩云霞，付文卓，王俐勇*

(1首都医科大学 医学实验与测试中心，北京 100069;2山东省莒县人民医院急诊科;*通讯作者，E-mail:wly0410@163.com)

目前，基因芯片在科研领域得到广泛应用，这些应用主要包括基因表达检测、突变检测、基因组多态性分析和基因文库作图以及杂交测序等方面。获取高质量的RNA是进行包括基因芯片、第二代高通量测序、数字化PCR、cDNA文库等很多分子生物学研究的必要前提［1-3］。基因芯片实验对于RNA的质量要求较高，这对RNA提取在完整性和纯度方面有了更高的要求。由于RNA非常不稳定，易被降解，RNA酶无处不在，获得高纯度且完整的RNA并不容易［4，5］。RNA的降解和组织内杂质的残留，会产生许多伪阴性的结果，芯片结果的可靠性大大降低，会影响实验结果甚至导致实验失败［6-9］。

尽管目前已经建立起许多RNA分离提取方法，并开发出若干商品化RNA分离提取试剂盒［10-18］，但对于像基因芯片和高通量测序等高质量要求的样本，其应用效果还需进一步验证［6，8］。为了达到提取高质量RNA提取效果的需求，本研究拟以小鼠脑组织为材料，以TissueLyserⅡ高通量组织研磨器为组织破碎匀浆工具，比较目前市面上较常见RNA提取试剂:天根生化科技有限公司组织总RNA提取试剂盒、Ambion公司组织总RNA提取试剂盒和Invitrogen公司的Trizol试剂提取的总RNA和反转录后cRNA质量的差异，并对提取方法进行优化改进，建立适合于基因芯片实验的组织高质量RNA提取方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 雄性 BALB/c小鼠(8-10周，SPF级，首都医科大学实验动物部)。

1.1.2 主要试剂 Trizol(Invitrogen公司);试剂盒Ⅰ:RNAprep pure动物组织总RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司);试剂盒Ⅱ:PureLink®RNA Mini Kit(Ambion公司);试剂盒Ⅲ:Illumina®TotalPrep RNA Amplification Kit(Ambion公司)。

1.2 方法

1.2.1 样品取材 小鼠分为3组提取总 RNA，每组5只。常规消毒后，快速断头取脑，预冷PBS简单冲洗后，剪成约20 mg小块，放入液氮速冻后，保存于-80℃冰箱备用。

1.2.2 总RNA 的提取方法

(1)Trizol法、试剂盒Ⅰ、试剂盒Ⅱ:每样品加Trizol或裂解液，并放入研磨珠，TissueLyserⅡ高通量组织研磨器高速震荡研磨，然后分别完全按照Trizol试剂、试剂盒Ⅰ、试剂盒Ⅱ操作说明进行。

(2)试剂盒Ⅰ改良方法:吸附柱CR3置于室温放置由2 min延长至5 min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液;吸附柱CR3中加入去蛋白液RW1或漂洗液RW，由直接离心改为室温放置30 s后再离心;最后向吸附膜的中间部位悬空滴加60μl RNase-Free ddH2O由常温改为提前60℃预热，室温放置2 min，12 000 r/min离心2 min;洗脱次数由一次改为二次，收集RNA溶液。其余步骤不变。

(3)试剂盒Ⅱ改良方法:吸附柱中加入漂洗液Ⅰ或漂洗液Ⅱ后，由直接离心改为室温放置30 s后再离心;最后由常温改为提取60℃预热的60μl RNase-Free ddH2O洗脱，室温放置放置时间由1 min延长至2 min，12 000×g离心2 min，洗脱次数由一次改为二次，收集RNA溶液。其余步骤不变。

(4)试剂盒Ⅲ:每样品取500 ng总RNA进行反转录。反转录合成第一条链cDNA;第二条链cDNA的合成;cDNA纯化;体外转录合成生物素标记的cRNA;cRNA纯化。流程完全按照试剂盒说明书进行，步骤繁多，在此不详述。

1.2.3 RNA、cRNA 产量、纯度和完整性测定RNA电泳分析:完整性RNA可用普通琼脂糖凝胶电泳，然后以紫外凝胶成像系统观察。电泳条件:1%普通琼脂糖凝胶，0.5×TBE电泳缓冲液，电压100 V，30 min。

Nanodrop2000分光光度计检测总RNA和cRNA浓度和纯度:吸取待测量样本1.5μl放在测量基座的表面，测定其在230、260和280 nm处的紫外吸光值。测得浓度值乘以RNA洗脱体积得到总RNA的产量。以 A260/A280、A260/A230比值做纯度分析，A260/A280≥1.9，A260/A230≥1.5 被认为纯度较好。

1.2.4 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件统计分析，实验结果以±s表示，以单因素方差分析进行统计学检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 总RNA电泳分析结果

对采用试剂盒Ⅰ的方法提取的总RNA经琼脂糖凝胶电泳后，28S、18S和5S电泳条带很弱，改良后得到的RNA电泳条带明显出现(见图1);采用试剂盒Ⅱ的方法提取的总RNA电泳后28S、18S和5S条带较清晰，改良后条带亮度有明显增加，28S和18S比值约为2，提示RNA完整性好;采用Trizol试剂法提取的RNA电泳后28S、18S和5S条带亮度最高，28S和18S比值在1-2之间，但伴有轻微拖尾现象。

图1 小鼠脑组织总RNA普通琼脂糖凝胶电泳图Figure 1 Agarose gel electrophoresis of total RNA from mouse brain

2.2 RNA、cRNA产量和纯度测定结果

不同方法提取的总RNA产量和纯度见表1。从表1可以看出，Trizol试剂法提取的总RNA产量高于两种试剂盒提取的总RNA产量，差异有统计学意义(P＜0.01);试剂盒Ⅰ、Ⅱ经改良后，RNA产量均有明显增加，与改良前相比差异有统计学意义(P＜0.01);试剂盒Ⅱ提取的总RNA产量显著高于试剂盒Ⅰ提取的总RNA产量，差异有统计学意义(P＜0.01);试剂盒Ⅰ、Ⅱ改良后 A260/A280、A260/A230的比值与改良前相比没有显著性差异;试剂盒Ⅱ的A260/A280、A260/A230的比值明显高于Trizol法和试剂盒Ⅰ，差异有统计学意义(P＜0.01)。

不同方法提取的总RNA均取500 ng进行反转录，得到的cRNA浓度见表2。以试剂盒Ⅱ法得到的cRNA浓度最高，与Trizol法和试剂盒Ⅰ相比，差异有统计学意义(P＜0.01)。试剂盒Ⅱ改良前后得到的cRNA浓度无统计学差异。

表1 不同方法提取小鼠脑组织总RNA的产量和纯度(±s，n=5)Table 1 RNA yield and purity by different RNA extraction methods(±s，n=5)

表1 不同方法提取小鼠脑组织总RNA的产量和纯度(±s，n=5)Table 1 RNA yield and purity by different RNA extraction methods(±s，n=5)

与试剂盒改良前相比，＊P＜0.01;与试剂盒提取法相比，#P＜0.01;与试剂盒Ⅰ相比，▲P＜0.01;与 Trizol法，△P＜0.01

Trizol法 56.58±9.13#1.82±0.74 1.568±0.33

表2 不同方法提取的小鼠脑组织总RNA反转录成cRNA的浓度(±s，n=5)Table 2 Concentration of cRNA by total RNA reverse transcription of different RNA extraction methods(±s，n=5)

表2 不同方法提取的小鼠脑组织总RNA反转录成cRNA的浓度(±s，n=5)Table 2 Concentration of cRNA by total RNA reverse transcription of different RNA extraction methods(±s，n=5)

与试剂盒Ⅰ相比，*P＜0.01;与 Trizol法相比，#P＜0.01

Trizol法330.20±48.66

3 讨论

获取高质量的RNA是进行基因芯片实验的必要前提［1-3］。基因芯片实验主要是以放大与信使RNA(mRNA)完全配对的互补RNA(cRNA)，再进行后续的芯片杂交实验。如果RNA存在严重的降解，那么许多mRNA并不能被忠实地放大，因此会产生许多伪阴性的结果，芯片结果的可靠性大大降低［6-10］。RNA中蛋白、酚类或胍盐等物质的残留，则可能干扰反转录反应的过程。

RNA质量控制一般通过样品吸光值比率和琼脂糖凝胶电泳进行评估，A260/A280的比值用于估计核酸的纯度，是否存在蛋白和苯酚污染;A260/A230比值用于估计脱盐程度［11-18］。基因芯片实验对样品的要求为:总 RNA浓度≥100 ng/μl，RNA总量≥2 μg，A260/A280≥1.9，A260/A230≥1.5，RNA 电泳 28S 与18S的比值接近2。按以上标准，Trizol法提取的RNA产量最高，A260/A280、A260/A230的比值基本满足基因芯片实验要求，但A260/A280、A260/A230的比值低于Ambion试剂盒提取法，且RNA电泳后28S、18S条带伴有轻微拖尾现象。天根试剂盒和Ambion试剂盒在方法改良后均取得了较理想的提取结果，RNA总量有明显提高，但天根试剂盒提取的RNA A260/A280，A260/A230比值偏低，这种纯度的 RNA可以满足普通RT-PCR试验需求，但无法保障基因芯片实验要求;而Ambion试剂盒提取的RNA A260/A280，A260/A230比值满足基因芯片实验要求;说明Ambion试剂盒改良后提取的RNA质量最佳。

基因芯片实验主要是以放大与mRNA完全配对的cRNA，再进行与芯片的杂交反应，杂交浓度为150 ng/μl。本实验中，取等量的RNA进行反转录得到的cRNA，以Ambion试剂盒提取的cRNA浓度最高，与Trizol法和天根试剂盒相比差异有统计学意义。进一步说明Ambion试剂盒提取的RNA质量优于Trizol法和天根试剂盒。

综上所述，Ambion试剂盒法提取的小鼠脑组织总RNA的产量和纯度均能满足芯片实验要求。本实验通过优化改良后得到的总RNA产量有显著提高，而且对RNA的纯度和完整性没有影响。

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