抗水通道蛋白4抗体诊断视神经脊髓炎的临床价值

苏国华，冯丽萍，刘立海（河北省沧州市人民医院神经内科 061000）

视神经脊髓炎是一种炎性中枢神经系统脱髓鞘神经疾病，主要影响人体的视神经和脊髓，临床表现为选择性的累及人体神经和脊髓，诱发脊髓炎或视神经炎，其病理改变的关键在于脱髓鞘、硬化斑、坏死空洞的形成，并伴随血管周围炎性细胞浸润［1］。近年来，随着大量临床研究的问世，视神经脊髓炎的免疫机制也逐渐确定，基本认为该病是一种选择性、侵袭性损伤视神经和脊髓的自身免疫性疾病［2］。本研究通过检查视神经脊髓炎患者的空腹抗水通道蛋白4抗体（抗AQP4抗体）水平，探讨神经脊髓型多发性硬化疾病中抗AQP4抗体的敏感性，并进一步研究抗AQP4抗体在神经脊髓炎临床诊断中的应用价值。现将相关研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2012年1月至2014年1月本院视神经脊髓炎患者100例，其中男10例，女90例。经伦理委员会审核批准，在事先征得患者同意的条件下，取100例视神经脊髓炎患者的血清标本进行临床检验，入选100例患者在不考虑抗AQP4抗体阳性的基础上按照2006年视神经脊髓炎的诊断标准进行临床诊断。

1.2 仪器与试剂间接免疫荧光检测法试剂选择F12coon′s、胎牛血清、LipofectamineTM2000、牛血清清蛋白（BSA）、兔抗人AQP4抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗人和羊抗兔IgG二抗、Cy3标记羊抗人IgG 二抗、琼脂糖等。

1.3 检测方法所有患者血清中AQP4抗体水平的检测均采用人AQP4转染细胞间接免疫荧光法，于转染前1d将FRT细胞（37℃，5%CO2条件下培养）应用0.25%的胰酶予以消化，在60%～80%的合适密度下将培养处理后的细胞接种于12孔板中；根据LipofectamineTM2000的说明书上的操作流程，将人AQP4质粒导入至FRT 细胞中，并于细胞转染后45h使用磷酸盐缓冲液（PBS）（含有4%多聚甲醛）进行固定，经0.1%聚氧乙烯辛基苯及醚磷酸盐缓冲液（Triton X－100PBS）通透后，应用PBS（含有2%的BSA）封闭液予以室温封闭；随后加入视神经脊髓炎患者血清，在4℃下孵育12h，用PBS清洗3遍，加入Cy3标记羊抗人IgG 二抗中和后使用PBS洗掉非特异性结合抗体，最后奥林巴斯BX60荧光显微镜下观察并摄取影像资料［3］。研究过程中阳性标本滴度的确定以1∶1000作为阳性滴度最大值，以64×为界值作为最小阳性滴度［3］。

2 结果

按照研究界定标准，100例视神经脊髓炎患者中53例为阳性。在分别转染至pcDNA3.1及pcDNA3.1－hAQP4质粒的FRT 细胞上视神经脊髓炎患者血清免疫染色结果提示：（1）转染空质粒FRT 细胞中并不存在特异性染色；（2）转染AQP4基因FRT 细胞中存在明显细胞膜染色；（3）水通道蛋白AQP4在细胞膜上的表达说明视神经脊髓炎患者血清中抗体有极大可能识别水通道蛋白AQP4。利用表达人AQP4抗体的FRT细胞通过高特异性的AQP4抗体阳性作为对照，检测视神经脊髓炎患者血清中含有的抗体识别靶蛋白，研究结果表明，AQP4抗体与视神经脊髓炎血清识别靶抗原为同种蛋白，即AQP4蛋白。抗AQP4抗体针对男性以及女性患者阳性率的比较情况，见表1。

表1 抗AQP4抗体在男性及女性患者阳性率的比较

3 讨论

临床上将视神经脊髓炎称为Devic病、Devic综合征等，其他亚洲国家称其为视神经脊髓炎型多发性硬化，属于先后或同时累及视神经及脊髓的急性或亚急性脱髓鞘疾病［4］。本研究主要探讨抗AQP4抗体在视神经脊髓炎患者血清中的表达，以及抗AQP4抗体在视神经脊髓炎临床诊断中的应用价值。作为水通道中在人体中枢神经系统表达最为丰富的成员，抗AQP4抗体参与了视神经脊髓炎、脑水肿等多种常见临床疾病的发病过程［4］。大量临床研究表明，抗AQP4抗体在大鼠脑中主要表达于星形胶质细胞及室管膜细胞当中，在与毛细血管及软脑膜直接相连接的胶质细胞表达十分丰富［5］。自从临床研究确认视神经脊髓炎－IgG 靶抗原为AQP4抗体以来，临床对于视神经脊髓炎这一疾病检测的灵敏度与特异性有了较为显著的提高，但AQP4抗体的特异性在视神经脊髓炎发病期间的确切作用临床上尚无明确解释［5］。

在许多临床研究中，AQP4抗体的特异性和高灵敏度均有助于视神经脊髓炎的临床诊断，本组研究显示100例视神经脊髓炎患者血清中自身免疫性抗体靶抗原为水通道AQP4抗体，进一步证实了AQP4抗体在视神经脊髓炎生理及病理过程中的重要作用。目前AQP4抗体已经成为视神经脊髓炎临床诊断标准中所包含的一项指标，并且AQP4抗体也是其他中枢神经系统免疫性疾病鉴别的重要实验室指标［6］。尽管AQP4抗体已经作为视神经脊髓炎临床诊断中一项必要的支持条件，但该诊断标准是建立在临床以及磁共振成像（MRI）检查的基础上的，AQP4抗体作为视神经脊髓炎疾病的一项支持诊断条件，能够明显提升诊断视神经脊髓炎的特异性。此外，尤为重要的是在其他中枢神经系统脱髓鞘疾病中，如临床尚不满足于MRI诊断，AQP4抗体则是唯一具有高特异性的能够鉴别视神经脊髓炎的诊断指标［6］。

本研究还发现，抗AQP4针对男性患者表现的阳性率为20.00%，针对女性患者的阳性率为72.22%，女性患者的阳性率明显高于男性患者（P＜0.05）。视神经脊髓炎在东西方的临床诊断中存在一定争论，日本一般将此类患者鉴别为多发性硬化，而欧美国家通常将此类患者诊断为视神经脊髓炎［7］；本研究用于检测AQP4抗体在视神经脊髓炎患者血清中高表达的实验室方法是目前国内最敏感的AQP4抗体检测法。与AQP4抗体阳性相关的一些临床表型，如不满足视神经脊髓发展成为中枢神经系统脱髓鞘疾病的常规诊断标准，这更加证实了AQP4抗体在视神经脊髓炎临床诊断鉴别中的价值及其在免疫性疾病特异性标记物和预测预后方面的临床价值。一般来说，AQP4抗体血清阳性患者的疾病有进一步发展或致残的危险性。因此，作者提倡检测视神经脊髓炎患者血清中的AQP4抗体表达，并且对于AQP4抗体阳性患者应给予免疫抑制剂治疗，以有效控制疾病的发展。

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