坤灵片中延胡索乙素含量测定的研究＊

万峰峰 杨 静 蔡慧侠 杨飞快 西安大恒制药有限公司（西安710118）

Δ西安金花制药厂（西安710065）

坤灵片为中药复方制剂，是由处方1中香附（制）、黄芪、益母草、五味子、白芍等17味药材和处方2中香附（制）、阿胶、牡丹皮、延胡索、当归、红参等15味药材组方［1］，由坤灵丸改变制剂成型工艺而成。具有调经养血，逐瘀生新的功效。用于月经不调，或多或少，行经腹痛，子宫寒冷，久不受孕，习惯性流产，赤白带下，崩漏不止，病久气虚，肾亏腰痛。其中延胡索所含的延胡索乙素等具有显著延长痛经模型大鼠的潜伏期及减少扭体次数的作用［2］。笔者保持原丸剂剂型的提取和粉碎干燥工艺，仅改变成型工艺，将其制成坤灵片，并研究了其延胡索乙素含量测定方法，现报道如下。

1 仪器与试药1.1 仪器 高效液相色谱仪：Agilent 1100四元梯度泵；VWD检测仪；Agilent 1100在线脱气机；Agilent 1100化学工作站（美国安捷伦公司）；色 谱 柱：迪 马 Diamonsil C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；AL204－IC型电子天平（梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司）、BP211D型电子天平（梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司）。

1.2 试药 对照品为延胡索乙素（批号：110728－200908，含量测定使用、从中国药品生物制品检定所购买）。坤灵片为实验室自制；硅胶G从青岛海洋化工厂采购；试剂中甲醇使用色谱纯（Fisher公司），水采用重蒸馏水，其他所用试剂则是分析纯。

2 延胡索乙素的含量测定2.1 色谱条件和系统适应性试验 色谱柱为迪马Diamonsil C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相为甲醇－0.1%磷酸溶液（用三乙胺调节Ph值至6.0）（63∶37）；检测波长为280nm。样品检测量为10μL。在上述实验条件下，其它组分及延胡索乙素色谱峰均能够与基线分离，延胡索乙素色谱峰与互相邻近的色谱峰分离度都大于1.5，且理论塔板数大于3000［3］。

2.2 制备对照品溶液的方法 将延胡索乙素对照品精密称取适量，加入甲醇，制备溶液中每1mL含30μg，得到对照品溶液。

2.3 制备供试品溶液的方法 取供试品40片，研至细粉，混合均匀，取约9.5g，精密称定，放于平底烧瓶中，将浓氨试液－甲醇（1∶20）混合溶液精密加入50mL，称定物料及瓶体总重量，先冷浸1h，再加热回流1h，放冷，再次称定物料及瓶体总重量，使用浓氨试液－甲醇（1∶20）混合溶液将减失的重量补足，摇至均匀，进行过滤。将续滤液精密吸取25mL，蒸至干燥，将残渣中加水40mL，搅拌溶解，用稀盐酸调Ph值2～3，用石油醚（60℃～90℃）振摇提取2次，每次20mL，再用10mL石油醚（60℃～90℃）振摇提取1次，合并石油醚层，用水10mL振摇提取1次，水相用石油醚（60℃～90℃）5mL振摇提取1次，弃去石油醚层，合并水层，用浓氨试液调Ph值9～10，用石油醚（60℃～90℃）振摇提取3次，每次40mL，再用30mL石油醚（60℃～90℃）振摇提取1次，合并石油醚层，用水30mL振摇提取2次，石油醚层蒸干，残渣加甲醇溶解，转移到5mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇至均匀，样品过滤，取续滤液，得到供试品溶液。

2.4 制备阴性样品检测用溶液的方法 除去延胡索以外的组方药材，均按照处方量称量，并采用规定的制备工艺完成样品制备，取得阴性样品（缺延胡索药材），按2.3中制备供试品溶液的方法进行制备，即得阴性样品检测用溶液。

2.5 测定方法及检测结果 分别精密量取按照2.2、2.3、2.4方法制备的对照品、阴性样品及供试品的溶液各10μL，按照液相色谱仪操作要求及2.1要求的色谱条件进行检测。检测结果显示，各色谱峰均峰形良好，理论塔板数及分离度均达到要求。供试品溶液的HPLC图中，在延胡索乙素对照品溶液的出峰位置能够检出相应色谱峰。而缺延胡索的阴性样品溶液的HPLC图中，延胡索乙素对照品出峰位置没有检测到其它色谱峰，说明采用2.1方法中的色谱条件对阴性样品（缺延胡索）进行检测，不会产生相关干扰。

2.6 对线性关系进行的相关考察 精密称定延胡索乙素对照品6.67mg，加甲醇制成每mL含33.35μg的对照品溶液。将2.2中制备的延胡索乙素对照品溶液精密吸取 3μL、6μL、9μL、12μL、15μL 和18μL，分次注入至液相色谱仪中，按照2.1方法中的色谱条件对峰面积进行测定，横坐标X为进样量（ug），纵坐标Y为平均峰面积，绘制出标准曲线，回归方程计算为：Y＝893.04X－2.75 r＝0.9999，线性范围：0.10005～0.6003μg［4］。

2.7 对精密度进行的相关研究 将样品溶液精密吸取10μL，连续并且重复的进样6次，对峰面积进行测定，延胡索乙素测得峰面积，RSD为1.34%（n＝6），说明该仪器精密度符合要求。

2.8 对供试品稳定性进行的相关研究 取同一次制备的供试品溶液，放置在室温下，于0、1、4、8和24 h分别测定，样品检测量为10μL。测量得到延胡索乙素的峰面积，经过计算，RSD求得为1.70%。该结果说明，供试品溶液在24h内稳定性符合要求。

2.9 对重复性进行的相关研究 取同一次制备的样品6份，分别按2.1中含量测定的方法对延胡索乙素含量进行测定，测得RSD为1.67%。该结果说明，该方法重现性符合要求［5］。

2.10 对回收率进行的相关研究 使用加样回收法，将已知含量的供试品（批号：20100501，含量：11.12μg/片）称取6份，各精密加入延胡索乙素对照品溶液（396μg/mL）0.5mL，按供试品制备方法和2.1中含量检测的方法进行测定，得到延胡索乙素的平均回收率为96.55%，RSD为0.99%。测定数据见表1。

表1 延胡索乙素回收率的实验结果

2.11 对样品的含量进行测定 按2.1方法中的检测条件对5批样品中延胡索乙素进行含量测定，测定数据见表2。

表2 延胡索乙素检测结果

3 讨论与小结关于延胡索中所含延胡索乙素的含量测定，参照2010版一部药典［6］延胡索药材项下的延胡索乙素含量测定项下的色谱条件，采用原流动相比例甲醇－0.1%磷酸溶液（三乙胺调Ph值至6.0）（55∶45）时，保留时间过长，在30min左右，且峰分离度差，背景较高，改进供试品处理方法并改变流动相比例（63∶37）后，样品HPLC延胡索乙素色谱峰分离良好，保留时间在20min左右，理论塔板数3000以上，基本可达基线分离，并能较好地和其他杂质峰分离。改进后的含量测定方法更加简便、高效。

［1］中华人民共和国卫生部药典委员会.卫生部药品标准中药成方制剂部颁标准［M］.北京中华人民共和国卫生部，1996：84.

［2］陈岳涛，曹 蔚，谢艳华，等，元胡止痛片及其重要成分对大鼠室验性痛经的影响［J］.陕西中医，2013，34（1）：111－113.

［3］张晓红 ，王月茹，卢新义，等.高效液相色谱法测定千金救心胶囊中延胡索乙素含量［J］.陕西中医，2013，34（7）：895－897.

［4］王新晓，卢剑锋.高效液相色谱法测定小儿清热口服液中绿原酸的含量［J］.陕西中医，2012，33（4）：483－484.

［5］惠婷婷，夏忠庭，张兰兰，等.HPLC测定郁舒颗粒芍药内酯苷和芍药苷的含量［J］.陕西中医，2012，33（4）：480－481.

［6］国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版：一部［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：123.