非小细胞肺癌患者血清游离DNA定量检测的临床意义

张世强，王保庆，王海清，张旭东

(1徐州医学院第二附属医院放疗三科，徐州 221006;2徐州医学院第二附属医院肿瘤内科;3徐州医学院第二附属医院呼吸内科;*通讯作者，E-mail:13952234612@163.com)

恶性肿瘤患者的血清中有大量的游离DNA存在，其含量约为健康人的10倍以上，研究［1－3］表明，在肿瘤的生长过程中，肿瘤细胞不断释放DNA进入外周血液，这类血清游离DNA的遗传特性与肿瘤细胞基因组DNA相同。国外学者通过检测肺癌患者血清游离DNA中的特定突变基因，指导临床个体化靶向治疗已经取得较好的临床疗效［4－6］，因此，血清游离DNA的检测在恶性肿瘤的诊断和治疗中具有重要的应用价值。本研究以非小细胞肺癌患者为研究对象，通过分析非小细胞肺癌患者治疗前后血清游离DNA水平的变化，以期为血清游离DNA水平在肺癌临床诊治中的推广应用提供依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

收集2013－05～2014－03收治的非小细胞肺癌患者65例，年龄41－74岁，中位年龄51.9岁;所有患者均有细胞病理学证据确诊，其中:I期8例、Ⅱ期24例、Ⅲ期18例、Ⅳ期15例;鳞癌34例、腺癌31例。32例Ⅰ－Ⅱ期的患者均采取手术治疗，33例Ⅲ－Ⅳ期患者采取相同的化疗方案治疗，同时收集健康志愿者60例作为对照组，年龄39－64岁，中位年龄44岁。所有研究对象均签署知情同意书，治疗前均排除肝炎、糖尿病、慢性炎症、高血脂及免疫性疾病史。

1.2 外周血样本采集及血清DNA提取

分别抽取检测对象前臂静脉血4 ml(肺癌患者在手术和化疗前后进行抽血)。室温放置2 h后用低温高速离心机将静脉血离心(20℃，3 000 r/min，10 min)，弃下液，取上层液血清1 ml放置入2 ml冻存试管，然后将血清置于－80℃冰箱保存备用。血清DNA以磁珠法全血基因组DNA抽提试剂盒(美国Omega公司生产)抽提，按说明书所述的方法抽提血清DNA。

1.3 血清游离DNA定量

参照文献［6］应用荧光定量PCR进行血清游离DNA的定量，设计表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)引物和荧光定量 PCR检测EGFR胞质区外显子28编码引物序列如下:上游引物:5’－CCTGTCATAAGTCTCCTTGTTGAG－3’，下游引物:5’－CAGTCTGTGGGTCTAAGAGCTAATG－3’，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。取2μl DNA进行定量PCR检测，血清游离DNA含量(单位:拷贝数/ml血清)按以下公式计算:C=Q×(VDNA/VPCR)×(1/Vext)，公式中 C为 EGFR拷贝数、Q为CPD(cytoplasmic domain)拷贝数、VDNA为DNA抽提后的体积(20μl)、VPCR为定量PCR检测时加入的DNA量(2μl)、Vext为用于抽提 DNA的血清体积(ml)。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 肺癌组及健康对照组血浆游离DNA水平比较

实验结果表明，65例非小细胞肺癌组血浆游离DNA 水平为(165.2±41.6)ng/ml，健康对照组血浆游离DNA水平为(13.8±6.3)ng/ml，肺癌组明显高于健康对照组，差异有统计学意义(P＜0.01，见表1)。

2.2 血浆游离DNA水平与肺癌临床病理特征的关系

肺癌组患者按照肿瘤大小、病理类型及临床分期进一步分组，结果表明，肿瘤直径＞3 cm的患者血浆游离DNA水平明显高于肿瘤直径＜3 cm的肺癌患者，差异具有统计学意义(P＜0.01)，同时Ⅲ－Ⅳ期的患者血浆游离DNA水平明显高于Ⅰ－Ⅱ期的肺癌患者，两者之间差异亦有统计学意义(P＜0.01)，而按照病理分型分组比较，鳞癌组与腺癌组的患者血浆DNA水平差异无显著性(P＞0.05，见表2)，提示肺癌患者血浆游离DNA水平与肿瘤负荷及临床分期有密切的关系，但与肺癌患者的病理分型无明显相关性。

表1 肺癌组以及对照组血浆游离DNA水平 (ng/ml)Table 1 Level of plasma DNA in lung cancer group and control group (ng/ml)

表2 血浆游离DNA水平与NSCLC临床病理特征的关系 (ng/ml)Table 2 Relationship between plasma DNA level and clinical pathological features of NSCLC (ng/ml)

2.3 血浆游离DNA水平与肺癌疗效的关系

32例患者采取手术治疗，其术后血浆游离DNA水平较术前显著性下降，与术前比较差异具有显著性(P＜0.01，见表3)，可能与患者术后体内肿瘤细胞负荷减少有关;另外，33例肺癌患者采取相同的化疗方案治疗，化疗有效的患者，其血浆游离DNA水平在化疗后明显下降，差异具有统计学意义(P＜0.01)，而化疗无效的患者，其血浆游离DNA水平在化疗后虽有一定程度的下降，但统计分析差异无显著性(P＜0.01)，进一步对两组患者化疗后比较发现，化疗有效的肺癌患者血浆游离DNA水平显著低于化疗无效的患者(P＜0.01)，提示血浆游离DNA水平治疗前后的变化可作为肺癌患者临床疗效的判断指标。

3 讨论

血清游离DNA是一种存在于体液中的游离状态的脱氧核糖核酸，正常人的外周血游离DNA来源于淋巴细胞或其他有核细胞，肿瘤患者的外周血游离DNA主要来源于肿瘤细胞的坏死或凋亡、循环肿瘤细胞裂解所释放，血清游离DNA与恶性肿瘤组织DNA具有相同的遗传变异特性［7］。众多研究表明［8－11］，血清游离DNA含量的检测具有广泛的临床应用价值，血清游离DNA检测有助于早期发现复发转移的高危人群。此外，血清游离DNA具有可动态观测的优势，因而在恶性肿瘤的治疗过程中检测血清游离DNA的变化趋势，有助于在判断临床疗效及指导治疗方案的及时调整。

在本研究中发现，非小细胞肺癌患者血清中DNA浓度比健康对照者明显升高(P＜0.01)，提示检测血浆游离DNA水平可作为肺癌早期筛选的重要指标之一，国外有关血清游离DNA与肿瘤的研究中也有类似的结论［12］。进一步分析发现，血清游离DNA和肺癌患者的肿瘤大小、临床分期有密切的关系，肿瘤直径＞3 cm或分期较晚的患者血浆游离DNA水平明显升高，统计学差异具有显著性(P＜0.01)，尤其对于肺癌术后及化疗有效的患者而言，血清游离DNA的水平明显下降(P＜0.01)，提示血清游离DNA的水平可间接反映肺癌患者体内的肿瘤负荷，同时可作为疗效评估的重要指标，国内学者温开镇等亦有类似的报道［13］。对肺癌患者不同病理类型血清游离DNA水平进行分析发现，腺癌患者和鳞癌患者之间血清游离DNA水平无明显差异，该结果与国内学者邓水秋的研究结果不一致［14］，其研究认为肺癌患者中腺癌患者血清游离DNA水平明显高于鳞癌患者，不一致的原因可能与本研究样本例数较小或未能采取随机的原则选择病例有关，故仍需进一步深入的探讨。

总之，血清游离DNA定量分析取材方便，对患者造成的痛苦较小，而且易于被患者接受，检测血清中游离DNA水平可间接反映肺癌患者体内的肿瘤负荷，而且在肺癌早期诊断及临床疗效的评价中具有一定的应用价值，值得进一步推广应用。

表3 血浆游离DNA水平在肺癌治疗前后的变化(ng/ml)Table 3 Changes of plasma DNA Level before and after treatment in patients with lung cancer (ng/ml)

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