镍铬合金的细胞毒性及对L929细胞Bax和Bcl-2表达的影响

孟 贺，孙 萌，张文茹，徐 强，李湛洁

(1河北联合大学口腔医学院修复教研室，唐山 063000;2河北联合大学附属医院超声科;3唐山市协和医院口腔科;4唐山市妇幼保健医院口腔科;*通讯作者，E-mail:menghe10.2@163.com)

镍铬合金由于其机械性能优良、制作简单、价格低廉，在口腔修复领域得到了很广泛的应用。近年来，人们越来越关注镍铬合金应用后的生物安全性问题及镍铬合金在口腔复杂环境下的离子释放行为。关于其可能引起的细胞损伤、局部组织和全身毒性反应等问题已有较多的研究，而关于镍铬合金对凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达的影响报道较少。本文选用临床上牙科修复常用镍铬合金材料作为研究对象，检测镍铬合金金属离子对小鼠成纤维细胞L929凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达的影响，探讨镍铬合金金属离子与细胞凋亡的关系。

1 实验材料和方法

1.1 细胞系

小鼠成纤维细胞L929，由天津塞尔生物技术有限公司细胞所提供。

1.2 试件的制作及浸提液的制备

精密铸造规格为15 mm×15 mm×2 mm的镍铬合金(Stellite，上海)试件8个，打磨抛光后，超声清洗15 min。去离子水冲洗数遍后置于玻璃小瓶中，将金属片于121℃高压灭菌后置于6孔板中。以含10%胎牛血清的RPMI1640培养液为浸提介质，按照试件表面积与浸提液体积比值为1.25×1 000 cm2/L的标准［1］，将浸提介质加入6孔板中，在37℃、5%CO2条件下连续浸提7 d，制备浸提液待用。

1.3 试剂和仪器

RPMI1640培养基(Gibco，美国)，胎牛血清(TBD，天津)，细胞培养箱(HERA Cell 150，Heraeu，德国)，倒置相差显微镜(Olympus，日本)，胰蛋白酶(GIBCO，美国)，兔抗鼠Bcl-2多克隆抗体(博奥森，北京)，兔抗鼠Bax多克隆抗体(博奥森，北京)、辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(博奥森，北京)、免疫组化试剂盒(PV6001，天津)。

1.4 L929细胞的生长代谢曲线

用0.25%胰蛋白酶消化对数生长期的L929细胞，分别以(1－10)×107个/L的细胞浓度接种于96孔板，每个浓度接种8个孔，然后将培养板置于孵箱中，在37℃、5%CO2、95%湿度的培养箱中，孵育72 h。加入5 g/L MTT溶液(每孔20μl)继续培养4 h，倒掉原液，PBS清洗后加入二甲亚砜(每孔150μl)室温下振荡20 min。在490 nm波长下用酶联检测仪检测吸光度(A值)。实验重复3次。

1.5 MTT实验检测镍铬合金细胞毒性

根据细胞生长代谢曲线确定L929细胞浓度，接种于96孔板，培养24 h，待细胞贴壁后，倒掉原培养液并将其分为镍铬合金组与阴性对照组，分别加入镍铬合金浸提液及含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，每组8个孔。培养48 h后，用酶联检测仪在波长490 nm条件下测各组吸光度(A)值，计算细胞相对增殖率(relative growth rate，RGR)，公式:RGR=(镍铬合金组A值/阴性对照组A值)×100%。根据毒性分级法评分:0级，细胞增殖率为≥100%;1级，75%－99%;2 级，50%－74%;3 级，25%－49%;4级，1%－24%;5级，0%。

1.6 免疫组化反应检测Bax、Bcl-2蛋白表达

实验分为镍铬合金组Bax、阴性对照组Bax、镍铬合金组Bcl-2及阴性对照组Bcl-2，将对数生长期的小鼠成纤维细胞L929以6×107个/L的浓度接种于放有盖玻片的6孔板中，加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养液培养24 h。待细胞贴壁后弃去原培养基，分别加入镍铬合金浸提液及含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，每组设立两个复孔，培养48 h。按照试剂盒说明书进行操作，镜下观察并拍摄照片。每张切片随机选取3个视野，Bax及Bcl-2在细胞质中呈棕黄色染色为阳性表达，以细胞未着色为阴性。在高倍镜(×400)下拍摄照片，并采用Image pro plus 6.0医学图像分析系统对Bax及Bcl-2蛋白表达强度进行半定量分析。Bax、Bcl-2阳性反应为胞质染成黄到棕黄颗粒和弥漫成片，阴性反应为细胞胞质未着色。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 L929细胞的生长曲线

对3次细胞生长曲线的实验结果进行相关性分析发现，在L929细胞的接种浓度为(1－7)×107个/L时，细胞的增殖率与浓度呈正的直线相关(t=35.49，P＜0.05，见图1)。根据生长曲线的实验结果，在 MTT实验中选取细胞的接种浓度为6×107个/L，接种于96孔板。

图1 3次生长曲线实验中接种细胞量与A值的关系Figure 1 Relationship between incubated cells and ODin growth curve

图2 两组Bax及Bcl-2蛋白的表达情况Figure 2 The expression of Bax and Bcl-2 in two groups

2.2 细胞增殖率检测

在MTT实验中发现镍铬合金组的细胞增殖率＞100%(见表1)，细胞毒性为0级。

表1 MTT实验中各组细胞增殖率比较Table 1 Cell proliferation in two groups by MTT

2.3 Bax、Bcl-2 免疫组化实验结果

采用Image pro plus 6.0医学图像分析系统对Bax和Bcl-2表达强度进行半定量分析，镍铬合金组与阴性对照组的Bax及 Bcl-2表达情况，及 Bax/Bcl-2光密度比值见图2(见第1003页)，表2。镍铬合金组Bax的表达高于阴性对照组，两组Bax的表达及Bax/Bcl-2的比值统计学差异显著(t值分别为2.841及5.365，P＜0.05);两组 Bcl-2 的表达无统计学差异(t=0.862，P＞0.05)。

表2 Bax及Bcl-2的光密度值及Bax/Bcl-2比值Table 2 OD value of Bax and Bcl-2 expression and their ratio

3 讨论

近些年，国内外学者对生物相容性的评价方法进行了大量研究，并且逐步倾向于利用现代分子生物学手段对生物材料的安全性进行客观有效的评价，使评价方法从整体水平到细胞水平再深入到分子水平，希望在分子水平上建立评价材料生物相容性的标准。戴建国等［2］研究发现，细胞周期检测可为生物材料的生物相容性评价提供新的思路和方法，并有望成为生物材料生物相容性评价研究的重要指标之一;洪岩松等［3］研究发现在时间梯度辅助下用caspase-3活化度评价4种齿科合金生物相容性，其结果与MTT法一致，可作为评价生物相容性的指标之一。从分子水平评价医用生物材料的安全性与有效性将成为未来生物材料领域的研究重点和前沿课题［4］。

生物材料必须具备良好的生物相容性才能确保临床应用的安全性［5］，许多生物材料的制备技术已经相当成熟，能够成功地应用于人体。然而，生物材料生物相容性的评价方法，仍有待进一步完善［6］。目前，关于生物材料生物相容性的评价方法主要包括体内实验和体外实验。体内实验是在动物体内植入生物材料，经过一段时间后，处死动物进行组织观察的方法。该法能够很真实地反映材料与生物体的反应情况，对于材料的临床应用是必要的。但是，需要对大量的动物进行长期观察，成本较高。体外实验法是在体外培养细胞，通过检测与材料作用后的细胞变化或一些特殊物质的产生与否，来反映材料的生物相容性，最常见的是通过MTT法检测材料对细胞增殖的影响而在细胞水平上评价材料的生物相容性。本研究采用MTT实验的方法，发现镍铬合金对L929细胞的增殖无明显影响，镍铬合金的细胞毒性为0级，具有良好的生物相容性。

细胞凋亡是指由细胞基因调控的一种自主性自杀现象;或者说细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自我结束生命的死亡方式。由于这种死亡方式是由基因调控引发的，因此也被称为程序性细胞死亡(programmed cell death)［7，8］。随着对细胞凋亡研究的深入，发现线粒体凋亡通路和死亡受体凋亡通路是细胞凋亡中两条主要的信号转导通路［9］。Bcl-2家族蛋白的表达和调控是影响细胞凋亡线粒体通路的关键因素之一，在细胞凋亡线粒体信号转导途径中发挥重要作用。B细胞淋巴瘤/白血病基因2(Bcl-2)和Bax分别是Bcl-2家族中最具代表性的抑制凋亡和促进凋亡基因［10，11］。Bcl-2 蛋白能够阻遏细胞凋亡，延长细胞的寿命，参与调控细胞增殖与凋亡的动态平衡，同细胞分化、成熟、组织器官的发育及肿瘤的发生有着密切的关系，Bax与Bcl-2相反，能促进线粒体促凋亡因子的释放，诱导细胞凋亡。牙科金属材料腐蚀析出的金属离子及其衍生物可引起机体组织的毒性反应，并可引起细胞凋亡［12，13］。本研究发现，与阴性对照组相比，镍铬合金浸提液组培养的小鼠成纤维细胞L929凋亡相关蛋白Bax表达增高，Bax/Bcl-2表达的比值增高，镍铬合金诱导小鼠成纤维细胞L929凋亡相关蛋白Bax表达增加。

本研究首先在细胞水平上通过MTT实验发现镍铬合金的细胞毒性为0级，然后，在分子水平上通过免疫组化实验检测镍铬合金对L929细胞凋亡相关蛋白Bax及Bcl-2表达的影响，发现镍铬合金可以诱导L929细胞凋亡相关蛋白Bax表达的增高，可能通过线粒体通路诱导细胞凋亡。希望本研究结果能为将来在分子生物学水平上建立评价生物材料生物相容性的标准提供实验依据。然而，由于凋亡机制复杂，如要进一步明确金属离子与细胞凋亡的关系还需更深入的研究。

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