十全大补汤多糖成分抑瘤及免疫调节作用的初步研究*

河北大学基础医学院

杜春海△ 戎瑞雪 王 梦△△ 贾 薇△△△ 曹志然 (保定071000)

肿瘤是危害人类健康的恶性疾病之一，很多抗肿瘤药物在杀灭癌细胞的同时对正常组织细胞，尤其是对骨髓和免疫细胞有一定的损害作用，从而降低肌体的抗肿瘤免疫功能，影响肿瘤的治疗效果。许多研究表明，一些经典的中药方剂在肿瘤的放疗和化疗方面有一定减毒增效作用。十全大补汤(SQDBT)为气血双补的著名方剂，前期研究中发现十全大补汤及其多糖成分在体内外均有明显的抗肿瘤活性。［1-4］为了进一步研究十全大补汤制剂的药效物质基础及抗肿瘤作用的机制，本文通过荷瘤小鼠结合体外细胞培养的方法，观察了十全大补汤多糖成分的抗肿瘤作用及作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6～8 周龄昆明种小鼠，雄性，40 只，体质量(20±2.0)g，由河北医科大学实验动物中心提供，合格证号121027。

1.2 细胞株 H 22小鼠肝癌实体瘤株:由河北医科大学基础医学院免疫学系惠赠，本实验室传代保存。

1.3 主要药品、仪器和试剂 十全大补汤组方中的生药(人参、白术、茯苓、甘草、白芍、熟地黄、黄芪、当归、川芎、肉桂)均购自保定市药材公司，经中医学院冯天铸教授鉴定均为真品。新生牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，RPMI-1640 培养液购自美国Gibco 公司;IL-2、TNF-α、IFN-γ ELISA 检测试剂盒购自深圳达科为生物技术公司，Annexin-Ⅴ-FITC/PI 双染凋亡检测试剂盒购自美国BD 公司，HF90 二氧化碳培养箱(上海力申科学仪器有限公司)。倒置显微镜(日本Olympus)，ELX－800 全自动酶标仪(美国宝特有限公司)，流式细胞仪(美国BD 公司)。

1.4 十全大补汤总多糖的提取 人参、白术、茯苓各16 g，甘草8 g，当归24 g，川芎8 g，白芍16 g，熟地黄24 g，黄芪16 g，肉桂4 g，加20 倍体积水分别1、1、0.5 h 回流提取3 次，提取液合并冷却后6 000 r/min，离心10 min;将上清液减压回收至5 倍体积，加体积比为80%乙醇，静置24 h，6 000 r/min 20 min;上述沉淀加5 倍体积蒸馏水溶解，加硫酸铵至沉淀完全溶解，用0.5%活性炭脱色后，抽滤后弃去沉淀;将滤液用少量80%乙醇洗涤多次去除多余硫酸铵，沉淀用少量水溶解，冷冻干燥后为总多糖成分，多糖获得率为19.22%。

1.5 荷瘤小鼠模型的建立及分组处理 常规复苏H22细胞，用含10%新生牛血清的培养基的RPMI-1640 培养液培养在5%CO2培养箱中，传代后，取处于对数生长期的H22细胞1×107接种于小鼠腹腔，10 d 后无菌条件下生长良好的H22荷瘤小鼠腹水，台盼蓝染色计数细胞活力＞95%，用无菌生理盐水调整细胞浓度为5×106/mL，接种于小鼠右腋部皮下，每只注射0.2 mL (含1×105个细胞)。在接种肿瘤细胞后24 h 随机分为5 组，每组8 只，称重并用苦味酸标记。1 组为阴性对照组:2 组为单纯顺铂(DDP)组;3 组为顺铂联合高剂量复合多糖组;4 组为顺铂联合中剂量复合多糖组;5 组为顺铂联合低剂量复合多糖组。3 组～5 组分别用168.4、84.2、42.1 mg/mL 总多糖灌胃，每天每只0.5 mL，连续10 d;2 组～5 组腹腔注射顺铂，1 mg/kg，1 次/d，连续10 d;阴性对照组用等量温开水灌胃和腹腔注射等量生理盐水。

1.6 十全大补汤总多糖对荷瘤小鼠体质量及肿瘤生长的影响 末次给药后24 h 将小鼠称重，小鼠眼球放血，分离血清备用。75%乙醇浸泡消毒，解剖摘取瘤块、用滤纸吸干后称重，计算抑瘤率。抑瘤率=(1－用药组平均瘤质量/模型对照组平均瘤质量)×100%

1.7 十全大补汤总多糖对肿瘤细胞和脾细胞凋亡的影响 无菌操作剥离肿瘤组织及脾脏，吸取表面的血液和组织液，称重后立即置含有冰PBS 的培养皿中，分别制备脾细胞悬液和肿瘤细胞悬液，200 目筛网过滤后调整细胞浓度为2×106/mL，AnnexinⅤ-PI 双染后流式细胞仪检测肿瘤细胞和脾细胞的凋亡率。

1.8 十全大补汤总多糖对荷瘤小鼠体内TNF-α，IFN-γ 和IL-2 分泌水平的影响 采用ELISA 法，按试剂盒说明操作。

1.9 数据的统计学处理 所有数据均用SPSS16.0 软件处理，采用单因素方差分析和t 检验。检验水准α=0.05，P＜0.05 表示差异有显著性。数据用±s 表示。

2 实验结果

2.1 十全大补汤总多糖对荷瘤小鼠体质量及肿瘤增长的抑制作用 结果显示:实验前各组小鼠体质量差异无显著，实验结束时顺铂对照组小鼠体质量明显低于阴性对照组，顺铂联合高、中剂量组小鼠体质量较单纯顺铂组有所增加，但仍低于阴性对照组。详见表1。

表1 十全大补汤总多糖对荷瘤小鼠体质量及瘤质量的影响 (±s)

表1 十全大补汤总多糖对荷瘤小鼠体质量及瘤质量的影响 (±s)

注:与阴性对照组比较，* P＜0.05;与单纯顺铂组比较，▲P＜0.05

组别 例数 体质量(g)实验第1天实验结束 瘤质量(g)抑瘤率阴性对照组8 22.21±1.89 33.23±2.24 1.35±0.33顺铂对照组 8 23.02±1.94 25.67±3.43* 1.05±0.21* 22%顺铂+高剂量多糖组 8 22.53±1.78 28.02±2.12＊▲ 0.87±0.28＊▲ 36%顺铂+中剂量多糖组 8 21.98±1.49 27.18±199.00＊▲ 0.85±0.25＊▲ 37%顺铂+低剂量多糖组 8 23.12±1.98 26.89±2.21*1.05±0.27 22%

2.2 十全大补汤总多糖对肿瘤细胞凋亡的影响结果显示:顺铂可明显诱导肿瘤细胞的凋亡，但主要以晚期凋亡(坏死)为主，与阴性对照组比差异有显著性(P＜0.05);而顺铂联合各剂量多糖组肿瘤细胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均明显高于顺铂对照组，且主要以早期凋亡为主，其中以顺铂联合高剂量多糖组作用最强。详见表2、图1。

表2 十全大补汤总多糖对肿瘤细胞凋亡的影响 (±s)，%

表2 十全大补汤总多糖对肿瘤细胞凋亡的影响 (±s)，%

注:与阴性对照组比较，* P＜0.05;与单纯顺铂组比较，▲P＜0.05

分组 例数 早期凋亡率(%) 晚期凋亡率(%)8 2.45±0.24 4.23±1.21顺铂对照组 8 3.65±1.63 23.87±2.23*顺铂+高剂量多糖组 8 16.33±2.45＊▲ 28.56±3.67＊▲顺铂+中剂量多糖组 8 14.89±3.34＊▲ 26.78±2.23＊▲顺铂+低剂量多糖组 8 13.76±2.87＊▲ 23.24±1.98阴性对照组＊▲

图1 十全大补汤总多糖对肿瘤细胞凋亡的影响

2.3 十全大补汤总多糖对荷瘤小鼠脾细胞凋亡的影响 结果显示顺铂可明显诱导荷瘤小鼠脾细胞的凋亡，其早期凋亡率和晚期凋亡率均高于阴性对照组，顺铂联合各剂量十全大补汤总多糖组脾细胞的凋亡率均明显低于单纯顺铂组(P＜0.05)，但仍高于单纯阴性对照组(P＜0.05)，表明十全大补汤总多糖可拮抗顺铂诱导的脾细胞的凋亡，对脾细胞有一定保护作用。详见表3、图2。

表3 十全大补汤总多糖对荷瘤小鼠脾细胞凋亡的影响 (±s)，%

表3 十全大补汤总多糖对荷瘤小鼠脾细胞凋亡的影响 (±s)，%

注:与阴性对照组比较，* P＜0.05;与单纯顺铂组比较，▲P＜0.05

分组 例数 早期凋亡率(%) 晚期凋亡率(%)8 1.34±0.43 2.23±1.32顺铂对照组 8 12.87±2.76* 25.66±3.43*顺铂+高剂量多糖组 8 5.33±1.47＊▲ 13.43±2.09＊▲顺铂+中剂量多糖组 8 6.54±0.87＊▲ 15.78±3.56＊▲顺铂+低剂量多糖组 8 8.90±2.03＊▲ 16.24±3.12阴性对照组＊▲

图2 十全大补汤总多糖对荷瘤小鼠脾细胞凋亡的影响

2.4 十全大补汤总多糖对荷瘤小鼠脾脏TNF-α、IFN-γ、IL-2 的影响 结果显示顺铂组小鼠脾细胞分泌TNF-α、IFN-γ、IL-2 的量明显低于阴性对照组(P＜0.05)，顺铂联合各剂量多糖组小鼠脾细胞TNF-α、IFN-γ、IL-2 的分泌水平明显高于单纯顺铂组(P＜0.05)，顺铂联合各剂量多糖组小鼠脾细胞IL-2 的分泌水平高于阴性对照组，但顺铂联合各剂量多糖组TNF-α 的分泌水平仍低于阴性对照组;顺铂+低剂量多糖组IFN-γ 的分泌与阴性对照组差异无显著(P＞0.05)。提示十全大补汤总多糖可刺激荷瘤小鼠的脾细胞合成和分泌TNFα、IFN-γ 和IL-2，但对各种细胞因子分泌的调节程度不同。详见表4。

表4 十全大补汤总多糖对荷瘤小鼠脾脏TNF-α、IFN-γ、IL-2 的影响 (±s)，pg/mL

表4 十全大补汤总多糖对荷瘤小鼠脾脏TNF-α、IFN-γ、IL-2 的影响 (±s)，pg/mL

注:与阴性对照组比较，* P＜0.05;与单纯顺铂组比较，▲P＜0.05

分组 例数 TNF-α IFN-γ IL-2阴性对照组569.22±4.43 74.09±2.12 80.55±5.65顺铂对照组 8 298.87±4.87* 47.32±2.30* 45.87±5.45*顺铂+高剂量多糖组 8 479.43±5.44＊▲ 108.31±3.01＊▲ 139.08±4.79＊▲顺铂+中剂量多糖组 8 432.86±4.87＊▲ 96.12±3.31＊▲ 132.86±4.87＊▲顺铂+低剂量多糖组 8 320.76±4.32＊▲ 72.04±2.34▲ 120.76±4.32 8＊▲

3 讨论

恶性肿瘤作为威胁人类健康的主要杀手之一，目前常用的化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时对肌体的正常组织尤其是免疫系统带来严重损伤，从而影响肿瘤的治疗效果。寻找无毒害作用的抗癌药物成为广大研究人员追求的共同目标。研究发现来源于中药的多糖不仅能对肿瘤细胞产生毒性作用，而且还能提高人体免疫力，其独特的药理作用已引起了国内外学者的广泛关注。大量研究证实多糖抗肿瘤作用的机制主要体现在两个方面:①直接作用于肿瘤细胞，可通过影响肿瘤细胞的细胞膜、干扰细胞内信号转导、抑制细胞周期和诱导细胞凋亡等发挥抗肿瘤作用;②通过激活淋巴细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞等多种免疫细胞，活化补体系统，有效促进多种细胞因子的分泌和表达，增强肌体免疫功能，发挥抗肿瘤作用。［5］因此，中药多糖作为一种免疫增强剂辅助化疗、放疗已成为肿瘤治疗的重要组成部分。但目前对多糖的研究大多是针对单味中药多糖，有关中药方剂中复合多糖的抗肿瘤及免疫调节作用的研究少有报道。

中药方剂是由不同药物根据中药配伍原则组成，各药之间相辅相成，具有比单味药更强的作用。十全大补汤是补血益气的代表方剂，临床主要用于贫血、产后虚弱、术后恢复等。有研究表明十全大补汤可抑制肿瘤的生长与转移、提高荷瘤肌体的免疫功能。［6-7］我们前期研究发现十全大补汤总多糖在体内外明显抑制肿瘤细胞的增殖，并能改善化疗所致的恶液质、贫血和白细胞下降等毒副作用。［2］本文通过体内实验结合体外细胞培养的方法进一步研究了十全大补汤总多糖在肿瘤化疗中减毒增效的作用机制。结果显示十全大补汤总多糖可明显促进顺铂诱导肿瘤细胞凋亡，且以早期凋亡为主。化疗药物最大的毒副作用是在杀伤肿瘤细胞的同时对免疫细胞也有杀伤活性，从而降低了肌体抗肿瘤免疫力，本文结果表明十全大补汤总多糖可明显拮抗顺铂所致的脾细胞的凋亡，对脾细胞具有保护作用。研究表明荷瘤肌体的抗肿瘤免疫以细胞免疫为主，在肿瘤细胞抗原的刺激下CD4+T 细胞活化、分化为Th1 细胞，通过分泌IL-2，IFN-γ，TNF-α 等细胞因子作用于其他免疫细胞从而发挥抗肿瘤免疫。［8－9］本研究结果显示接种肿瘤细胞后荷瘤小鼠血清中均可监测到IL-2，IFN-γ，TNF-α 的分泌，其中以TNF-α 分泌水平最高。顺铂可降低荷瘤小鼠上述3 种细胞因子的分泌，而顺铂联合应用十全大补汤总多糖组各种细胞因子的分泌水平均显著高于单纯顺铂化疗组，尤其是IL-2 和IFN-γ 的分泌水平均高于阴性对照组，且有剂量依赖性，表明十全大补汤总多糖可拮抗顺铂导致的细胞免疫功能受损状态，提高荷瘤小鼠的抗肿瘤细胞免疫功能。

综上所述，十全大补汤总多糖可明显协同顺铂导致的肿瘤细胞凋亡，其作用机制一方面可能与该复方多糖直接作用于肿瘤细胞，诱导其凋亡;其次也可能是通过激活NK 细胞，单核吞噬细胞，CTL等免疫细胞，促进其合成分泌细胞因子，从而诱导肿瘤细胞的凋亡，即十全大补汤总多糖抗肿瘤作用机制是多方位、多环节，不仅可以直接作用于肿瘤细胞，而且还从细胞水平，分子水平调节荷瘤肌体的免疫功能。今后若能借助于先进的分离和分析技术，结合临床实践进行更加深入的研究，进一步发挥其抗肿瘤的增效低毒的优势。

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