东方明珠杨梅挥发油成分及抗肿瘤活性研究

刘涛+彭志军+金吉芬+罗欢+范建新+罗福贤

摘要：采用水蒸气蒸馏法提取东方明珠杨梅（Myrica rubra cv. Dongfangmingzhu）挥发油，通过气相色谱-质谱（GC-MS）法对其化学成分进行分析和鉴定，使用MTT法研究挥发油对肿瘤细胞MGC-803、Bcap-37、PC3和A549体外增殖的抑制活性。从东方明珠杨梅的挥发油中鉴定出33个化合物，已鉴定组分占挥发油总量的93.76%，包括棕榈酸（13.99%）、石竹烯（11.82%）、角鲨烯（6.17%）、β-谷甾醇（5.39%）、2， 2'-亚甲基双-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）（4.76%）、2， 4-二叔丁基-5-甲基苯酚（4.28%）、二十七烷（4.15%）、二十九烷（4.11%）、三十四烷（3.47%）和二十五烷（3.30%）等。该挥发油对肿瘤细胞的体外增殖具有较好的抑制作用，并与浓度呈正相关。结果表明，东方明珠杨梅挥发油中含有烷烃类、有机酸类、酯类萜类、醇类、酚类、甾体类等多种成分，并表现出较好的抗肿瘤活性，为其深层次的开发利用提供了科学依据。

关键词：东方明珠杨梅（Myrica rubra cv. Dongfangmingzhu）；挥发油；气质联用；抗肿瘤

中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）18-4418-04

杨梅（Myrica rubra Sieb. et Zucc.）属杨梅科（Myricaceae），原产于中国的亚热带，世界上有60多种，中国有6种[1-4]。杨梅为药食两用的芳香植物[5]，宋代《食疗本草》和明代《本草纲目》中对杨梅的药用功效均有记载[6]。杨梅枝叶和根皮在中国大陆、台湾地区和日本等地常用作收敛剂、解毒剂和肠胃止泻剂等[7]。其主要活性成分黄酮类化合物具多种药理活性[8]，如杨梅叶中的杨梅素、槲皮素等均具有抗氧化作用、清除体内活性氧自由基功能，同时还具有降血压、抗炎、抑菌、抗氧化活性等多种功效，药用价值较高[9]。东方明珠杨梅（Myrica rubra cv. Dongfangmingzhu）是浙江省衢县名特优经济林良种繁育中心培育出的经济性状和生长特性优良且稳定的东魁2号，2001年通过浙江省林木良种审定，定名为东方明珠杨梅[10]。

挥发油亦称精油，是存在于植物体内的一类具有芳香气味、常温下能挥发的油状成分[11-13]。挥发油作为次生代谢物，是植物体抵御致病菌侵害的重要物质，绝大多数植物挥发油具有优良的体外抗真菌作用[14-16]。目前，东方明珠杨梅的挥发油化学成分及生物活性的研究还未见报道。该试验采用水蒸气蒸馏法提取东方明珠杨梅果实挥发油，使用气相色谱-质谱（GC-MS）法对其化学成分进行分析和鉴定，同时采用MTT法研究其抗肿瘤生物活性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

东方明珠杨梅果实由贵州省荔波县甲良杨梅基地提供，于2013年6月采摘同株树上成熟度一致的果实，剔除烂果。

RPMI 1640培养基（美国GIBICO公司）；胰蛋白酶（美国SIGMA公司）；MTT和SDS（北京鼎国生物技术发展有限公司）。

胃癌细胞株MGC-803、乳腺癌细胞株Bcap-37、前列腺癌细胞株PC3以及肺癌细胞株A549购自中科院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。

1.2 仪器与设备

ISQ型气相色谱-质谱联用仪（美国Thermo公司）；灭菌锅YXQ-LS-50（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；旋涡混合器XW-80A（上海精科实业有限公司）；CO2培养箱（日本SANYO公司）；胎牛血清（FBS）（天津市灏阳生物制品科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 挥发油的提取 将新鲜东方明珠杨梅去皮、去子，阴凉处风干后，用水蒸气蒸馏法提取，经无水硫酸钠干燥后得浅黄色油状挥发油。

1.3.2 色谱条件 HP-5 MS 5% phenyl Methyl Siloxane（0.25 μm×0.25 mm×30 m）弹性石英毛细管柱，柱温以50 ℃起始，并以5 ℃/min升温到280 ℃，保持10 min；气化室温度250 ℃，载气为高纯He （99.999%），载气流量1.5 mL/min，进样量为1 μL（用将样品稀释的溶液），不分流。

1.3.3 质谱条件 离子源为EI源，离子源温度为280 ℃，电子能量是70 eV，接口温度为280 ℃，溶剂延迟2 min，质量范围40～550 amu。

1.3.4 抗肿瘤活性测试 取对数生长期细胞，用0.25%（m/V）胰蛋白酶消化后，重悬于含10%（V/V） FBS的RPMI 1640的培养基中，以2×104 mL的终浓度接种于96孔培养板上，每孔100 μL，置于37 ℃、5%（V/V）CO2的饱和湿度培养箱中培养。24 h后吸掉培养基，加入含不同浓度样品的有血清培养基，每孔200 μL。放入培养箱培养72 h后吸取含药培养基，加入浓度为0.5 mg/mL的MTT，每孔100 μL，培养4 h后每孔再补加100 μL 10%（m/V）SDS，放入培养箱10 h，使结晶充分溶解后取出，冷却至室温，在595 nm下测OD值，计算抑制率。同时设空白对照组、阴性对照组和阳性对照组。空白对照组不加细胞只加有血清RPMI1640培养基，阴性对照组加入与药物同体积的二甲亚砜，阳性对照组加入与被测药物同浓度的阿霉素。

2 结果与分析

2.1 挥发油成分分析

东方明珠杨梅挥发油的总离子流图如图1所示。总离子流图中各峰经质谱扫描后所得的质谱图，采用质谱数据库检索（NIST数据库），人工谱图解析，按各峰的质谱裂片与文献核对，查对有关质谱资料、质核比和相对丰度等方面进行比较核对，东方明珠杨梅挥发油分析结果如表1所示。endprint

由图1可知，从样品中分离出57个组分，鉴定出33个（表1），包括烷烃、有机酸、酯类萜、醇、酚、甾体等化合物，鉴定成分占总挥发油成分的93.76%。总挥发油成分中有10种化合物含量超过总量的3%，分别为：棕榈酸（13.99%），石竹烯（11.82%），角鲨烯（6.17%），β-谷甾醇（5.39%），2，2'-亚甲基双-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）（4.76%），2，4-二-叔-丁基-5-甲基苯酚（4.28%），二十七烷（4.15%），二十九烷（4.11%），三十四烷（3.47%）和二十五烷（3.30%）。

2.2 抗肿瘤生物活性测试

将东方明珠杨梅挥发油倍比稀释成不同浓度，以胃癌细胞（MGC-803）、乳腺癌细胞（Bcap-37）、前列腺癌细胞（PC3）和肺癌细胞（A549）为对象，使用MTT法分析其体外抗肿瘤生物活性（3次重复），结果见表2。

由表2可以看出，东方明珠杨梅挥发油具有较明显的肿瘤细胞体外增殖抑制活性，随着浓度逐步加大，抑制率逐渐升高，挥发油对各细胞系的IC50值见图2。

从图2可以得出，东方明珠杨梅挥发油对Bcap-37细胞的体外增殖抑制活性最好（IC50=1.30 ± 0.24 mg/mL），PC3细胞次之（IC50=2.25 ± 0.19 mg/mL）。

研究表明，β-谷甾醇还具有较好的抗肿瘤作用，可抑制肿瘤生长并诱导肿瘤细胞的分化，对肿瘤细胞具有抗增殖活性与可激活鞘磷脂循环、细胞周期阻滞、刺激肿瘤细胞凋亡、抗氧化活性和免疫功能的调节等[17，18]。同时据报道，挥发油中的角鲨烯具有提高体内超氧化物歧化酶（SOD）活性、增强机体免疫能力、改善性功能、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤等多种生理功能[19]。因此，挥发油中的甾体和萜类物质可能是其中的主要活性因子。

3 小结

该试验采用水蒸气蒸馏法提取东方明珠杨梅果实的挥发油，并使用GS-MS法分析了其化学成分，鉴定了33个化学成分，包括烷烃、有机酸、酯类萜、醇、酚、甾体等化合物，占总挥发油成分的93.76%。挥发油对肿瘤细胞MGC-803、Bcap-37、PC3和A549的体外增殖具有较好的抑制作用，研究表明，东方明珠杨梅具有一定的药用价值。该研究为深入开发利用相关资源提供了参考。

参考文献：

[1] 李静锋，刘丽彬，高筱英，等.宝岩杨梅种植的气候条件分析[J]. 广西农学报，2010，25（3）：50-52.

[2] 吴国芳.中国地杨梅属植物的分类和地理分布[J].华东师范大学学报，1992（3）：79-103.

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[9] 王定勇，陈铭祥，刘恩桂，等.杨梅属植物药理活性研究进展[J]. 时珍国医国药，2010，21（4）：1028-1029.

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[11] 杨晓东，肖珊美，韩 铮，等.杨梅果实挥发油的气-质联用分析[J].果树学报，2008，25（2）：244-249.

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[13] 瞿新华.植物精油的提取与分离技术[J].安徽农业科学，2007， 35（32）：10194-10195.

[14] 刘洪波，史冬辉，张 瑜. 植物精油抗菌活性研究进展[J].畜牧与饲料科学，2009，30（1）：12-14.

[15] 孙立影，于志晶，李海云，等.植物次生代谢物研究进展[J].吉林农业科学，2009，34（4）：4-10.

[16] 刁银军，许玲玲，麻佳蕾，等.GC-MS联用分析三个品种杨梅树叶的挥发油组分[J].化学分析计量，2009，18（1）：25-28.

[17] 王 莉，归绥琪.β-谷甾醇抗肿瘤作用研究[J].国际肿瘤杂志， 2009，36（9）：676-679.

[18] 李庆勇，姜春菲，张 黎，等.β-谷甾醇、豆甾醇诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡[J].时珍国医国药，2012，23（5）：1173-1175.

[19] 荣维广，刘华良，李 莉，等.超高效液相色谱法测定保健食品中角鲨烯[J].预防医学情报杂志，2013，29（8）：734-736.endprint

由图1可知，从样品中分离出57个组分，鉴定出33个（表1），包括烷烃、有机酸、酯类萜、醇、酚、甾体等化合物，鉴定成分占总挥发油成分的93.76%。总挥发油成分中有10种化合物含量超过总量的3%，分别为：棕榈酸（13.99%），石竹烯（11.82%），角鲨烯（6.17%），β-谷甾醇（5.39%），2，2'-亚甲基双-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）（4.76%），2，4-二-叔-丁基-5-甲基苯酚（4.28%），二十七烷（4.15%），二十九烷（4.11%），三十四烷（3.47%）和二十五烷（3.30%）。

2.2 抗肿瘤生物活性测试

将东方明珠杨梅挥发油倍比稀释成不同浓度，以胃癌细胞（MGC-803）、乳腺癌细胞（Bcap-37）、前列腺癌细胞（PC3）和肺癌细胞（A549）为对象，使用MTT法分析其体外抗肿瘤生物活性（3次重复），结果见表2。

由表2可以看出，东方明珠杨梅挥发油具有较明显的肿瘤细胞体外增殖抑制活性，随着浓度逐步加大，抑制率逐渐升高，挥发油对各细胞系的IC50值见图2。

从图2可以得出，东方明珠杨梅挥发油对Bcap-37细胞的体外增殖抑制活性最好（IC50=1.30 ± 0.24 mg/mL），PC3细胞次之（IC50=2.25 ± 0.19 mg/mL）。

研究表明，β-谷甾醇还具有较好的抗肿瘤作用，可抑制肿瘤生长并诱导肿瘤细胞的分化，对肿瘤细胞具有抗增殖活性与可激活鞘磷脂循环、细胞周期阻滞、刺激肿瘤细胞凋亡、抗氧化活性和免疫功能的调节等[17，18]。同时据报道，挥发油中的角鲨烯具有提高体内超氧化物歧化酶（SOD）活性、增强机体免疫能力、改善性功能、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤等多种生理功能[19]。因此，挥发油中的甾体和萜类物质可能是其中的主要活性因子。

3 小结

该试验采用水蒸气蒸馏法提取东方明珠杨梅果实的挥发油，并使用GS-MS法分析了其化学成分，鉴定了33个化学成分，包括烷烃、有机酸、酯类萜、醇、酚、甾体等化合物，占总挥发油成分的93.76%。挥发油对肿瘤细胞MGC-803、Bcap-37、PC3和A549的体外增殖具有较好的抑制作用，研究表明，东方明珠杨梅具有一定的药用价值。该研究为深入开发利用相关资源提供了参考。

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由图1可知，从样品中分离出57个组分，鉴定出33个（表1），包括烷烃、有机酸、酯类萜、醇、酚、甾体等化合物，鉴定成分占总挥发油成分的93.76%。总挥发油成分中有10种化合物含量超过总量的3%，分别为：棕榈酸（13.99%），石竹烯（11.82%），角鲨烯（6.17%），β-谷甾醇（5.39%），2，2'-亚甲基双-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）（4.76%），2，4-二-叔-丁基-5-甲基苯酚（4.28%），二十七烷（4.15%），二十九烷（4.11%），三十四烷（3.47%）和二十五烷（3.30%）。

2.2 抗肿瘤生物活性测试

将东方明珠杨梅挥发油倍比稀释成不同浓度，以胃癌细胞（MGC-803）、乳腺癌细胞（Bcap-37）、前列腺癌细胞（PC3）和肺癌细胞（A549）为对象，使用MTT法分析其体外抗肿瘤生物活性（3次重复），结果见表2。

由表2可以看出，东方明珠杨梅挥发油具有较明显的肿瘤细胞体外增殖抑制活性，随着浓度逐步加大，抑制率逐渐升高，挥发油对各细胞系的IC50值见图2。

从图2可以得出，东方明珠杨梅挥发油对Bcap-37细胞的体外增殖抑制活性最好（IC50=1.30 ± 0.24 mg/mL），PC3细胞次之（IC50=2.25 ± 0.19 mg/mL）。

研究表明，β-谷甾醇还具有较好的抗肿瘤作用，可抑制肿瘤生长并诱导肿瘤细胞的分化，对肿瘤细胞具有抗增殖活性与可激活鞘磷脂循环、细胞周期阻滞、刺激肿瘤细胞凋亡、抗氧化活性和免疫功能的调节等[17，18]。同时据报道，挥发油中的角鲨烯具有提高体内超氧化物歧化酶（SOD）活性、增强机体免疫能力、改善性功能、抗衰老、抗疲劳、抗肿瘤等多种生理功能[19]。因此，挥发油中的甾体和萜类物质可能是其中的主要活性因子。

3 小结

该试验采用水蒸气蒸馏法提取东方明珠杨梅果实的挥发油，并使用GS-MS法分析了其化学成分，鉴定了33个化学成分，包括烷烃、有机酸、酯类萜、醇、酚、甾体等化合物，占总挥发油成分的93.76%。挥发油对肿瘤细胞MGC-803、Bcap-37、PC3和A549的体外增殖具有较好的抑制作用，研究表明，东方明珠杨梅具有一定的药用价值。该研究为深入开发利用相关资源提供了参考。

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[16] 刁银军，许玲玲，麻佳蕾，等.GC-MS联用分析三个品种杨梅树叶的挥发油组分[J].化学分析计量，2009，18（1）：25-28.

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[19] 荣维广，刘华良，李 莉，等.超高效液相色谱法测定保健食品中角鲨烯[J].预防医学情报杂志，2013，29（8）：734-736.endprint