富硒发芽对大豆蛋白凝胶性质的影响*

王素雅，胡丹丹，杨晓亚，鞠兴荣

(南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省粮油品质控制与深加工技术重点实验室，江苏南京，210023)

大豆中含蛋白质40%左右，是我国人民重要的蛋白质来源。但大豆含有胰蛋白酶抑制因子、植物凝集素和植酸等抗营养因子，会影响人体对其营养成分的吸收利用。大豆发芽不仅能减少胰蛋白酶抑制因子、植酸以及植物凝集素等不利于人体消化吸收的因子，而且水溶性维生素、大豆异黄酮和γ-氨基丁酸等有益成分含量增加，并形成新型风味和口感，是营养丰富的健康食品［1］。

硒是人体必需的微量元素，但我国2/3的地区缺硒［2］，补充富硒食物是解决硒缺乏的重要途径。通过种子发芽法将无机硒转化为有机硒，具有工艺简单、操作简便、生产稳定、周期短、产品易于标准化、成本低等优点，因此，富硒发芽产品备受研究者关注［3－4］。大豆在食品中的应用不仅与其营养价值相关，也与其蛋白质的功能性质也密不可分。由于许多大豆加工品利用其凝胶性质，因此，凝胶性质是大豆蛋白最重要的功能性质之一。然而，发芽对大豆凝胶性质有一定的影响［5］，因此，探讨富硒发芽过程对大豆蛋白凝胶性质的影响，可为开发不同形式的富硒大豆产品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验原料与药品

大豆:东北大豆，购自南京原粮市场。

葡萄糖酸-δ-内酯(GDL):江苏常州康力食品添加剂厂。

Na2SeO3，NaOH，HCl，正己烷，乙醇，NaClO，NaBH4，甘油，异丙醇，苯酚，甘氨酸，丙烯酰胺，N，N'-甲叉双丙烯酰胺，三羟甲基氨基甲烷(Tris)，四甲基乙二胺(TEMED)，考马斯亮蓝R250，十二烷基硫酸钠(SDS)，过硫酸铵，β-巯基乙醇，溴酚蓝，以上所用试剂均为分析纯(AR)或生化试剂。

硒标准溶液(1 000μg/mL):Sigma公司;标准蛋白(14.4～97.4kDa):Solarbio公司。

1.2 实验仪器设备

HG75－3型电热恒温两用箱，南京实验仪器厂;PHS－25型pH计，上海精密科学仪器有限公司;HH－6型恒温水浴锅，常州市国华电器有限公司;TDL－80－2B型离心分离机，上海安亭科学仪器厂;FW100型高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器有限公司;AIPHAI-4LDpluo真空冷冻干燥机，德国Marin Chris;Bio-Rad165－8003型电泳仪/电泳槽，美国Bio-Rad公司;TA.XT2i型物性测试仪，英国Stable Micro Systems Ltd;AFS-3100双道原子荧光分光光度计，北京科创海光仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 富硒大豆籽粒发芽

挑选成熟饱满，无虫蛀，无霉变，无破损的大豆种子，20 g，用质量分数1.0%的NaClO溶液浸泡5 min消毒，蒸馏水冲洗后，分别加50 mL 10 mg/L Na2SeO3溶液(富硒)和蒸馏水(对照)，于恒温(25℃)培养箱中浸泡6 h，将浸泡后的大豆粒置于25℃恒温培养箱中发芽，每隔12 h取样，96 h后停止发芽。豆芽用蒸馏水冲洗3遍，置于60℃烘箱中烘干，备用。

1.3.2 硒含量测定

采用氢化物发生原子荧光法测定硒含量(GB5009.93－2010)。

总硒(total selenium，T-Se)含量的测定:称取0.5 g 大豆粉于消化管中，加 10 mL HNO3、2 mL H2O2，振摇混合均匀，于微波消化仪中消化。消化完全后转入三角瓶中，加几粒玻璃珠，在电板上继续加热至近干，切不可蒸干，再加5.0 mL 6mol/L HCl，继续加热至溶液变为清亮无色并伴有白烟出现，将6价硒还原成4价硒。冷却，转移消化液于25 mL容量瓶中定容，用于总硒含量的测定。

大分子有机硒(organic selenium，O-Se)的测定采用持续透析法［4］。将大豆粉装入透析袋(截留分子质量3 500kDa)，25℃去离子水透析5 d，每隔12 h换1次水，测定透析后袋里样品硒含量即为有机大分子有机硒的含量。

1.3.3 GDL大豆凝胶的制备

将发芽大豆加水(料液比1∶6，g∶mL)磨浆，纱布过滤，豆浆在不断搅拌下小火煮沸3～5 min，脱气。向豆浆中加入2.8 g/L GDL并混匀，85℃保温20 min后，放入冰水中冷却成型，4℃冰箱保存备用。

1.3.4 大豆分离蛋白的制备［6］

发芽大豆→60℃烘干→磨粉→正己烷脱脂→烘干→碱提酸沉法提取→冷冻干燥→SPI

1.3.5 GDL大豆分离蛋白凝胶制备［5］

120 g/L的SPI溶液→90℃水浴加热15 min→加2.8 g/L GDL→80℃保温30 min→冷却→4℃保存备用。

1.3.6 大豆蛋白质分子质量的测定

SDS-PAGE法［7］:采用15%的分离胶和5%的浓缩胶，电泳时的电压200 V，电流100 mA，功率50 W。3～4 h后，待溴酚蓝刚刚迁移出凝胶底部时终止电泳，考马斯亮蓝染色2 h，将凝胶置于脱色液中漂洗，每隔2 h换1次脱色液，直至背景清晰为止。

1.3.7 凝胶硬度的测定［5］

用TA-XT2i质构仪测定大豆凝胶与大豆分离蛋白凝胶硬度，主要参数如下:运行模式texture profile analysis(TPA);测前速度2.0 mm/s;测试速度1.0 mm/s;测后速度3.0 mm/s;穿刺距离10 mm;时间2 s;数据采集速率200 pps;圆柱型探头(P/0.5)。凝胶破碎时受到的最大力作为凝胶硬度指标，力越大凝胶硬度越大。

1.3.8 凝胶持水性测定［8］

按1.3.3和1.3.5的方法于10 mL的离心管内制备大豆凝胶和大豆分离蛋白凝胶，称重后(记为m1)于4℃下4 000r/min离心10 min，记录离心过程中水分损失量(m2)，计算凝胶持水性(WHC)。

2 结果与讨论

2.1 富硒发芽过程中大豆总硒与有机硒含量的变化

经Na2SeO3溶液浸泡后，大豆在发芽过程中总硒含量与有机硒含量均有所增加。由图1可知，10 mg/L Na2SeO3溶液浸泡6 h后，大豆中总硒含量为1.25 μg/g。发芽 12 h 后，总硒含量增至 3.48 μg/g，至发芽48 h时总硒含量趋于稳定，发芽96 h时总硒含量为4.60 μg/g，是未发芽大豆的3.68倍。分析认为Na2SeO3在大豆发芽过程中随水分子不断向大豆内部渗透，促使发芽大豆总硒含量升高。大豆中大分子有机硒含量和有机硒转化率在发芽过程中也呈不断上升趋势，发芽12 h时有机硒含量为0.51 μg/g，有机硒转化率14.57%;发芽至96 h时，有机硒含量增至 2.05 μg/g，转化率达 44.50%。Sathe［9］等人利用同位素示踪技术发现，富硒大豆中89%的硒与蛋白质结合，其中大豆分离蛋白占60%。因此，发芽时大豆有机硒含量及有机硒转化率增加是Se与蛋白质结合并以硒蛋白形式存在的结果。

2.2 富硒发芽过程中大豆蛋白分子质量的变化

大豆蛋白根据沉降系数的不同分为2S，7S，11S和15S球蛋白。其中主要由7S和11S球蛋白组成，分别占大豆分离蛋白的30%和40%［10］。7S球蛋白主要成分是 β-大豆伴球蛋白(β-conglycinin)［11］，由α’(MW～72 kDa)，α(MW～68 kDa)和 β(MW～52 kDa)3个亚基组成，各亚基之间几乎无二硫键［12］。11S球蛋白的主要成分是大豆球蛋白(glycinin)，由6个亚基对经非共价键连接而成，每一对亚基由1个酸性亚基(MW～32 kDa)和1个碱性亚基(MW～20 kDa)通过1个二硫键相连［13］。11S大豆球蛋白有5种亚基。各亚基的分子质量约为:A3～37 kDa，A1，A2，A4～34 kDa，B3～23 kDa，B1，B2，B4～22 kDa［14］。

实验分析了不同发芽时间富硒大豆SPI的SDSPAGE电泳图谱，结果见图2。图谱从上到下的区带分别是7S球蛋白(α’，α，β)区带和11S球蛋白(A3，A1A2A4，B3，B1B2B4)区带［12］。由图2可知，发芽过程中大豆7S球蛋白的β亚基与11S球蛋白的碱性亚基B含量没有明显变化，而7S球蛋白的α’亚基和α亚基与11S球蛋白的酸性A3、A随着发芽而逐渐减少。发芽48 h内，这4种亚基快速减少，说明它们是大豆内源蛋白酶的主要作用对象，被降解为相对分子质量较小的组分。在相同发芽条件下，富硒大豆与对照大豆的蛋白谱带基本一致，说明富硒处理并未影响蛋白质的代谢途径，该结果与吴永尧［15］在富硒水稻和赵镭［16］在富硒灵芝的研究结果一致，硒进入蛋白质代谢但并不改变蛋白质原来的合成代谢途径。

图2 发芽大豆分离蛋白的SDS-PAGE电泳图谱Fig.2 SDS-PAGE profile of SPI during soybean germination

2.3 富硒发芽过程中大豆凝胶硬度的变化

蛋白质凝胶形成的机理非常复杂，参与形成凝胶网络结构的作用力包括疏水作用、二硫键、氢键和静电相互作用［17］。蛋白质分子受热变性后，原包埋于卷曲结构内部的疏水基团暴露出来，同时，高温使蛋白质分子热运动加剧，分子间相互碰撞的机率增大，因而有助于分子间通过疏水相互作用形成交联。而且蛋白质变性后暴露出极性的—CO和—NH，使多肽链附近形成水化层，有利于形成氢键。此外，加热还会引起—SH和—S—S—的交换反应，形成分子间或分子内的二硫键合，这些相互作用和二硫键合导致蛋白质凝胶的形成［18］。

以葡萄糖酸内酯(GDL)为凝固剂，富硒发芽大豆GDL凝胶硬度随发芽时间的变化见图3。由图3可知，在发芽过程中大豆GDL凝胶硬度逐渐降低，特别是在发芽48 h内，大豆GDL凝胶硬度由25.25g快速降低至10.77g，降低了57.35%。蛋白质是形成大豆凝胶的主体，因此分析了富硒发芽大豆分离蛋白(SPI)的凝胶硬度随发芽时间的变化。由图4可知，在发芽12 h至60 h，发芽大豆SPI的凝胶强度快速下降。发芽48 h时富硒大豆分离分离蛋白GDL凝胶硬度由27.73g降至13.37g，降低了51.79%，与发芽大豆GDL凝胶硬度的变化趋势一致。根据发芽大豆蛋白质电泳图谱可知，此时7S球蛋白的α’亚基和α亚基与11S球蛋白的酸性亚基A3、A降解速度较快，导致蛋白质聚合度降低，凝胶网络结构变疏松，从而造成大豆蛋白凝胶硬度降低，说明这些蛋白亚基对大豆蛋白凝胶形成具有重要的作用［19］。由图3，图4还可看出，发芽过程中富硒大豆的凝胶硬度均略高于对照。硒酸盐被植物吸收后，按照硫的代谢途径被进一步同化［20］，因此硒在植物体内主要是以硒代半胱氨酸(Se-Cys)的形式存在［4］。大豆蛋白质分子在受热变性后，Cys残基之间形成分子内或分子间的S-S是大豆凝胶形成的原因之一，富硒大豆蛋白中的Se-Cys形成分子内或分子间的Se-Se键，根据Shchedrina［20］，用来还原 S-S 的二硫苏糖醇(DTT)无法还原Se-Se，只有非常强的还原剂才能还原Se-Se，因此Se-Se的解离能要高于S-S，解离能高，化学键强度大，分子本身结构稳定，这可能是富硒发芽大豆的凝胶硬度略高于对照的原因。

图3 发芽过程中大豆凝胶硬度的变化Fig.3 Changes of soybean gel hardness during germination

图4 发芽过程中SPI凝胶硬度的变化Fig.4 Changes of SPI gel hardness during soybean germination

2.4 富硒发芽过程中大豆凝胶持水性的变化

持水性体现了豆腐凝胶网络结构的致密性，是豆腐重要特性之一。富硒发芽大豆及其分离蛋白GDL凝胶的持水性见图5和图6。由图5可知，未发芽的富硒大豆GDL凝胶持水性为61.42%，而随着发芽时间的延长，发芽大豆凝胶的持水性几乎呈线性降低，至发芽96 h时，富硒发芽大豆凝胶的持水性降至40.34%，降低了34.32%。由图6可知，未发芽富硒大豆SPI凝胶的持水性为62.64%，在发芽60 h内SPI凝胶的持水性持续降低，发芽60 h时凝胶持水性为50.95%，该结果与大豆凝胶持水性的变化趋势一致。根据电泳图谱可知，大豆7S球蛋白的α’亚基和α亚基与11S球蛋白的酸性亚基A3和A亚基因发芽而逐渐降解，对蛋白凝胶网状结构造成破坏，在豆腐凝胶结构中产生较大空洞，因此持水性下降［19］。从图5，图6还可看出，发芽过程中富硒发芽大豆的凝胶持水性均略高于对照，原因与富硒大豆凝胶的网络强度高于对照，能更好地将水分锁在凝胶网络结构内有关。

图5 发芽过程中大豆凝胶持水性的变化Fig.5 Changes of WHC of soybean gel during germination

图6 发芽过程中大豆分离蛋白凝胶持水性的变化Fig.6 Changes of WHC of SPI gel during soybean germination

3 结论

经Na2SeO3溶液浸泡6 h后，在发芽的96 h内，总硒含量、有机硒的含量及有机硒转化率均随发芽时间的延长而增加。发芽96 h时大豆总硒含量为4.60 μg/g，有机硒含量增至2.05μg/g，转化率达44.50%，说明大豆发芽过程具有较强的硒生物转化能力。富硒大豆和SPI的GLD凝胶硬度与持水性均随发芽时间的延长而降低。在发芽48 h内，大豆GLD凝胶硬度从25.25g迅速降至10.77g，持水性由61.42%降至51.55%，SPI凝胶硬度从27.73g降至13.37g，持水性由62.64%降至55.54%。富硒大豆SPI的凝胶硬度及持水性均较对照略高，但两者没有明显差异，说明富硒对发芽大豆凝胶性质影响有限。根据发芽过程中大豆凝胶性质的变化规律，可将发芽48 h内的富硒大豆用于开发富硒豆腐类产品，将发芽48 h以后的大豆用于开发豆脑、豆浆等产品。

SDS-PAGE图谱显示，富硒大豆的蛋白谱带与对照组基本一致，说明富硒没有显著改变蛋白质的代谢。在发芽过程中，大豆7S球蛋白的α'亚基和α亚基与11S球蛋白的酸性亚基A3亚基和A亚基随发芽时间的延长而被逐渐降解为相对分子质量较小的组成，从而影响发芽大豆凝胶性质，而富硒对大豆蛋白质凝胶性质的影响较小。

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