虫草枸杞复合发酵工艺研究

杨小萍，岳思君，徐春燕，苏建宇

(宁夏大学生命科学学院，西部特色生物资源保护与利用教育部重点实验室，宁夏银川，750021)

蛹虫草(Cordyceps militaris)又称北冬虫夏草，属麦角菌科(Clavicipitaceae)虫草菌属(Cordyceps)［1］，其活性成分和药理作用与冬虫夏草相似［2－5］，具有补肺益肾、滋补强身、抗癌、抗疲劳、抗衰老、提高免疫力等功效［6］，其中尤以虫草菌素、虫草酸和虫草多糖的药用价值最为显著［7］。

研究表明，枸杞能促进蛹虫草的生长和有效成分的积累，使蛹虫草的产量得到提高、保健功能得到增强［8］。同时，虫草对枸杞中的糖类、蛋白质、纤维等物质的利用，以及在代谢过程中对一些重要的有效成分进行转化，有助于提高枸杞活性成分在复合制剂中的功效［9］。本文在蛹虫草液体培养不同时期加入以不同方式获取的枸杞汁，对其复合发酵工艺进行研究，并对发酵产物有效成分含量及清除羟自由基能力进行比较分析，以期开发出一种兼具虫草和枸杞二者活性物质的发酵制品。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 供试菌种

蛹虫草(Cordyceps militaris 14013)，购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，实验室保藏。

1.1.2 枸杞

市售宁夏中宁枸杞。

1.2 培养基

种子培养基:NaNO33 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，Mg-SO40.5 g，FeSO40.01 g，蔗糖30 g，水1 000 mL，pH 6.0。

发酵培养基:NaNO33 g/L，K2HPO41 g/L，KCl 0.5 g/L，MgSO40.5 g/L，FeSO40.01 g/L，另添加一定量的枸杞汁，并根据加入枸杞汁的含糖量添加蔗糖使其终浓度为30 g/L，pH 6.0。

1.3 实验方法

1.3.1 蛹虫草摇瓶发酵

种子培养:从试管斜面中切取约1 cm2带培养基的斜面菌丝，接入装有75 mL种子培养基的250 mL摇瓶中，25℃、150 r/min 培养 4 d。

虫草枸杞复合发酵:500 mL摇瓶中装入150 mL发酵培养基，接种量10%，25℃、150 r/min振荡培养。

1.3.2 枸杞汁的制备

枸杞水提液制备:称取枸杞10 g，洗净，加6倍水浸泡1 h后，煮沸30 min，倒出枸杞汁，再在枸杞渣中补加适量的水，煮沸20 min，合并枸杞汁，过滤，定容至1 000 mL。以3，5-二硝基水杨酸法测定枸杞汁中的糖含量。

枸杞匀浆液制备:称取枸杞10 g，洗净，加6倍水浸泡1h后，榨汁机粉碎，纱布过滤得匀浆液，再在枸杞渣中补加适量的水，重复打磨2次。合并枸杞汁，过滤，定容至1 000 mL，制备成浓度为10 g/L的枸杞匀浆液。按上述方法分别制备20、30和40 g/L的枸杞匀浆液。以3，5-二硝基水杨酸法测定枸杞汁中的糖含量。

1.3.3 发酵产物干重的测定

取一定量的摇瓶发酵液，4 000 r/min离心20 min，弃上清液，水洗，重复数次，至上清液为无色。收集沉淀，于80℃烘至恒重，在干燥器中冷却至常温，称重并研磨成细粉，重复5次。

1.3.4 虫草素的提取与测定

微波提取法［10］:精确称取0.1 g发酵产物，加入20 mL蒸馏水中，微波处理60 s，功率200 W，过滤，滤液定容至250 mL，各组重复3次。用紫外分光光度法［11］测定虫草素含量。

1.3.5 虫草酸的提取与测定

精确称取0.2 g发酵产物，加入20 mL 70%的乙醇中，微波处理80 s，功率200 W。过滤，蒸馏水洗涤残渣，将滤液、洗液合并于100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，从中吸取1.0 mL于100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，作为待测样品，各组重复3次。用紫外分光光度法测定虫草素含量。

1.3.6 多糖的提取与测定

热水浸提法［12］:称取发酵产物0.5 g，加入15 mL蒸馏水中，70℃水浴浸提2.5 h。提取液10 000 r/min离心10 min，上清液定容至15 mL，吸取1 mL，稀释至250 mL，为待测样品，各组重复3次。用苯酚硫酸法［16］测定胞内多糖含量。

1.3.7 发酵产物清除羟自由基能力测定

采用羟自由基测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)，按照说明书中方法测定。

2 结果与分析

2.1 枸杞汁制备方式的选择

为了确定复合发酵过程中枸杞汁适宜的制备方式，分别取75 mL 10 g/L的枸杞水提液和枸杞匀浆液加入75 mL发酵培养基中，使培养基中枸杞汁浓度分别为5g/L。以不添加枸杞汁为对照，发酵168 h，每24 h取样测定发酵产物干重，结果如图1所示。

图1 虫草生长曲线Fig.1 The growth curve of Cordyceps militaris

由图1可知，不添加枸杞汁时，蛹虫草培养48 h后进入快速生长期，96 h时发酵产物干重达到最大为5.50 g/L，并在96～144 h基本保持不变，144 h后发酵产物干重开始下降，生长进入衰亡期。生长期菌体平均生长速率为0.16 g/h。

培养基中添加枸杞水提液，蛹虫草培养24 h后进入快速生长，96 h时发酵产物干重达7.00 g/L，120 h时获得最大发酵产物干重为7.60 g/L，144 h后进入衰退期。生长期菌体平均生长速率为0.20 g/h。

培养基中添加枸杞匀浆液，蛹虫草培养24 h后进入快速生长期，96 h时发酵产物干重达7.60 g/L，144 h时获得最大发酵产物干重为8.20 g/L，168 h后进入衰退期。生长期菌体平均生长速率为0.24 g/h。

结果表明，培养基中添加枸杞汁可以提高菌体生长速率，增加发酵产物干重。其中添加枸杞水提液发酵产物干重较对照增加38.18%，添加枸杞匀浆液菌体最高发酵产物干重较对照增加49.09%。由于枸杞匀浆液较多地保留了枸杞的成分，对蛹虫草生长的促进作用更为明显，且制备简便，便于工业化生产，因此，虫草-枸杞复合发酵过程中枸杞汁的制备方式以匀浆法更为适宜。

2.2 枸杞汁添加量的确定

按1.2所述，分别添加浓度为10、20、30和40 g/L的枸杞匀浆液配制发酵培养基，使发酵培养基中枸杞汁浓度分别为5、10、15和20 g/L，以不添加为对照，摇瓶发酵144 h，测定发酵产物干重和虫草有效成分含量，结果如图2和图3所示。

图2 添加不同浓度枸杞汁的发酵产物干重Fig.2 Fermentation product dry weight with adding different concentrations of Lycium barbarum juice

培养基中枸杞匀浆液浓度为10 g/L时发酵产物干重最大为7.60 g/L，较对照提高了37.43%，浓度为5 g/L时次之，为6.23 g/L，较对照提高了12.66%。

培养基中添加10 g/L枸杞匀浆液时，发酵产物虫草素含量显著增加，为13.18 mg/g，较对照增加了52.48%，其他添加5 g/L和20 g/L的枸杞匀浆液则无显著变化。

培养基中枸杞匀浆液浓度为5 g/L时发酵产物多糖含量显著增加，为19.29 mg/g，较对照提高了23.81%，10 g/L枸杞匀浆液则无显著变化。

图3 添加不同浓度枸杞汁的虫草有效成分含量Fig.3 Active ingredients contents of Cordyceps militaris with adding different concentrations of Lycium barbarum juice

与对照组相比，随着枸杞匀浆液浓度的增加，虫草酸含量逐渐降低，枸杞匀浆液浓度为5 g/L时虫草酸含量与对照组相当。

综合考虑发酵产物干重和产物有效成分含量，枸杞匀浆液的最适添加浓度应为5 g/L。

2.3 枸杞汁添加时期的确定

由虫草生长曲线(图1)可知，培养基中添加枸杞匀浆液后，蛹虫草培养至24～96 h时进入快速生长期，96 h后虫草生长进入稳定期。为保证枸杞汁的充分利用与转化，选择在虫草进入快速生长期之前和之中(即虫草发酵第0、24、48和72 h)加入枸杞匀浆液。发酵培养基中枸杞汁浓度为5 g/L，根据加入枸杞汁的含糖量添加蔗糖使其终浓度为30 g/L。发酵144 h，测定发酵产物干重和虫草有效成分含量，结果如图4和图5所示。

图4 枸杞液不同加入时期的发酵产物干重Fig.4 Fermentation product dry weight with adding Lycium barbarum juice in different period

由图4可知，枸杞匀浆液的添加时期对发酵产物干重有显著影响(P＜0.05)，发酵48 h加入枸杞匀浆液时，发酵产物产量最大为13.04 g/L，较虫草菌丝体提高了135.80%，发酵72 h时加入次之，发酵产物产量为11.73 g/L，较虫草菌丝体提高了112.12%。

图5 枸杞液不同加入时期的虫草有效成分含量Fig.5 Active ingredients contents of Cordyceps militaris with adding Lycium barbarum juice in different period

由图5可知，枸杞匀浆液的添加时期对产物虫草素含量无显著影响(P＞0.05)，但对产物虫草酸和多糖含量影响显著(P＜0.05)，在发酵第72 h时加入枸杞匀浆液，产物虫草酸和多糖含量均为最大，分别为178.21和30.73 mg/g。

综合考虑发酵产物产量和有效成分含量，在发酵第72 h时加入枸杞匀浆液最为有利，在此工艺条件下发酵144 h，复合发酵产物产量可达11.73 g/L，较虫草菌丝体升高了112.12%。其中虫草素含量达11.23 mg/g，虫草酸含量178.21 mg/g，多糖含量达30.73 mg/g，分别较虫草菌丝体升高了29.98%、64.46%和97.20%。

2.4 虫草枸杞复合发酵产物清除羟自由基能力

按照以上复合发酵工艺发酵144 h，对复合发酵产物清除OH·能力进行测定，结果如图6所示。从图6中OH·清除能力可以看出，复合发酵产物清除OH·能力为39 643 U/g，介于枸杞和单纯虫草粉之间，比未添加枸杞匀浆液的虫草粉提高了44.62%。枸杞富含枸杞多糖，其清除OH·能力最高，为50 126 U/g。对比图6中每升发酵液所含或者所获取样品的OH·清除能力可以发现，由于配制发酵培养基时每升发酵培养基中添加的枸杞为5.00 g，而虫草发酵和复合发酵所获得的产物产量分别为5.53 g/L和11.73 g/L，使得从每升发酵液中获得的复合发酵产物具有最高的OH·清除能力。进一步比较发现，复合发酵产物的OH·清除能力(46 501 U/L)显著高于虫草粉和枸杞的加和(39 588 U/L)，由此说明复合发酵过程中可能发生了有效物质的生物转化。综上，培养基中添加枸杞匀浆液在提高发酵产物干重和有效成分含量的同时，显著提高了发酵产物清除OH·能力，提示复合发酵产物具有更好的抗氧化性。

图6 三种样品清除羟自由基能力比较Fig.6 Comparison of hydroxyl radical scavenging activities of the three samples

3 结论

通过对蛹虫草液体发酵过程中添加枸杞汁的研究，确定了虫草枸杞复合发酵工艺条件为:以匀浆法制备枸杞汁，培养基中枸杞汁浓度5 g/L，发酵72 h时添加，发酵周期144 h，复合发酵产物产量达11.73 g/L，较虫草菌丝体升高了112.12%。其中虫草素含量为11.23 mg/g，虫草酸含量为178.21 mg/g，多糖含量为 30.73 mg/g，较虫草菌丝体分别提高了29.98%，64.46%和97.20%，同时，复合发酵产物清除OH·能力较虫草菌丝体提高了44.62%。

虫草枸杞复合发酵工艺的确定对开发兼具虫草和枸杞二者活性物质的新型功能发酵制品具有重要的参考意义。

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