桑黄菌丝多糖的提取及多糖成分分析
2014-11-20许谦
许谦
摘要:以桑黄(Phellinus igniarius)菌丝体为材料,探索热水提取法提取桑黄菌丝体多糖的工艺,并分析桑黄多糖的主要组成成分。试验在100 ℃的恒温下,以多糖提取率为考察目标,分别对提取料液比(m/V,g:mL)和提取时间进行考察,利用硅胶薄层分析的方法,对桑黄多糖的成分做初步测定。热水提取的最优工艺为在水提温度为100 ℃条件下,料液比1∶45、浸提时间3.5 h,此时桑黄粗多糖提取率为3.99%;桑黄菌丝体多糖的单糖组成初步确定有D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖和D-乳糖。
关键词:桑黄(Phellinus igniarius);热水提取法;多糖;正交试验
中图分类号:S646.9;TQ464.1 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2014)18-4405-03
桑黄(Phellinus igniarius)是一种珍贵的药用真菌,主要寄生在桑树、杨树等树干上。目前,关于桑黄的文献报道主要集中在多糖提取、抗癌机理及分子结构研究等。现代医学研究表明,一些桑黄子实体的提取物具有明显的抗癌作用,对小鼠肉瘤S180的抑制率为96.7%,对小鼠艾氏癌的抑制率为87%[1]。药理学研究表明,三萜、多糖和黄酮类物质是其活性成分,其中以多糖为主[2,3],在实际多糖产出中,菌丝体粗多糖含量是子实体的22.48倍[4]。有体外细胞试验表明,蛋白多糖与粗多糖对肿瘤细胞EC109和SiHa的抑制率没有明显差异[5]。
目前,常用的桑黄多糖的提取方法有热水提取法[6]和超声波辅助提取法[7],这两种方法时间长,但操作简单。欧阳小丽等[8]研究了微波法提取茶薪菇菌丝体多糖的最佳工艺,无论在节能、高效还是在试验操作方面,微波法都是最适的工艺,但是微波法有其局限性,即不适于大批量的工业生产。本试验采用常用的热水提取法提取桑黄菌丝多糖,优化最佳提取工艺,从而提高桑黄菌丝多糖得率,以期对工业发酵生产起到一定的指导作用。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
材料:桑黄菌丝体;D-葡萄糖,D-木糖,D-半乳糖,L-阿拉伯糖,L-鼠李糖,D-乳糖;硅胶G薄层板。
Sevage试剂:三氯甲烷∶正丁醇=4∶1。
展开剂:正丁醇∶甲醇∶氯仿∶冰醋酸∶水=12.5∶4.5∶5.0∶1.5∶1.5。
葡萄糖标准溶液:精密称取105 ℃下干燥恒重的分析纯葡萄糖0.058 2 g,置于小烧杯中,加去离子水溶解并转移至1 000 mL 容量瓶中,摇匀,配制成浓度为0.058 2 mg/mL葡萄糖标准溶液。
蒽酮-硫酸试剂:精密称取蒽酮200 mg于100 mL容量瓶中,用80%浓硫酸缓慢定容至刻度,边加边搅拌,摇匀,直至蒽酮完全溶解,此时溶液呈黄色透明状。将得到的蒽酮-硫酸试剂放于棕色瓶中置于阴凉处密封保存(当日配制使用)。
显色剂:二苯胺1 g,苯胺1 mL,85%磷酸5 mL混合溶解于50 mL丙酮溶液中。
仪器:恒温水浴锅;离心机;真空干燥箱;层析缸。
1.2 试验方法
1.2.1 桑黄菌丝体干粉的制备 取适量(6 g)桑黄菌丝体,用去离子水洗净,置50 ℃烘箱中干燥12 h,取出后充分研磨成粉,然后用100目筛过滤,备用。
1.2.2 试验设计 以多糖提取率为考察目标,在100 ℃的恒温下,分别对提取料液比(m/V,g:mL,下同)和时间进行考察,每个条件下取桑黄菌丝体干粉0.2 g,按照2个因素3个水平共有9种设计方案进行桑黄菌丝体多糖的提取,按相应的提取料液比加入去离子水,于相应温度下提取相应的时间;提取液经3 500 r/min离心15 min,取上清液进行粗多糖的制备。
1.2.3 醇沉法得粗多糖[9] 采用乙醇等有机试剂作沉淀剂,通过降低多糖溶液的介电常数和溶解度,使多糖从溶液中沉淀出来。精确量取一定体积的多糖溶液,与3倍体积的95%的乙醇混匀,4 ℃下沉淀过夜,3 500 r/min离心15 min,收集沉淀,干燥得桑黄粗多糖。
1.2.4 sevage法脱蛋白 取桑黄粗多糖溶于热水(10 mL)中,按多糖溶液体积加入0.2倍sevage试剂 ,混合后剧烈震荡30 min,静置1 h,3 500 r/min离心20 min,取上清液后再加入0.2倍sevage试剂,重复此操作2次,至有机层无沉淀为止。收集上清液,从上清液中取1 mL用于多糖含量测定,剩余上清液用4倍体积无水乙醇4 ℃沉淀多糖,次日3 500 r/min离心15 min,收集沉淀,并依次用丙酮、无水乙醇、乙醚洗涤,常规干燥得脱蛋白多糖,用于多糖成分的分析。
1.2.5 蒽酮-硫酸法测定多糖含量[10]
1)多糖得率测定。多糖得率=多糖质量/桑黄菌丝体干粉质量×100%
2)标准曲线的制作及粗多糖吸光度的测定。准确移取浓度为0.058 2 mg/mL 葡萄糖标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL置于具塞试管中,以去离子补足至1 mL,加入蒽酮-硫酸试剂4 mL,加塞,立即摇匀。迅速浸于冰水浴中冷却,各管加完后置于100 ℃水浴中显色10 min,管口加塞,以防水分蒸发。取出,冰浴速冷至室温,以去离子水为空白,于620 nm波长处测吸光度。以标准葡萄糖含量(mg/mL)为纵坐标,以吸光度(A)为横坐标,绘制标准曲线。
取“1.2.4”中上清液1 mL稀释8倍,再从中精确量取1 mL于试管中,加入蒽酮试剂4 mL,立即摇匀。迅速冷却后于100 ℃水浴中显色10 min。取出,冰浴速冷至室温,于620 nm波长处测定其吸光度。代入回归方程求出多糖溶液中多糖含量。
1.2.6 桑黄菌丝体多糖成分分析 运用薄层色谱法分析多糖组成成分[11]。
1)精确称取脱蛋白多糖10 mg,10 mg样品中加入5 mL 1 mol/L硫酸,密封试管100 ℃下水解4 h,水解液冷却后加入足量碳酸钡中和,4 500 r/min下离心10 min后收集上清液,沉淀以5 mL 50%乙醇洗涤后再离心,合并上清液。上清液于40 ℃下真空干燥,残渣溶于1 mL去离子水中备用。
同样,精确称定D-葡萄糖3 mg、D-木糖3 mg、 D-半乳糖3 mg、L-阿拉伯糖3 mg、L-鼠李糖3 mg、D-乳糖3 mg各溶于2 mL去离子水中制成对照糖溶液。
2)薄层色谱层析。①硅胶G薄层板。试验前取一块硅胶G板于110 ℃烘箱中活化1 h,取出后即可使用,亦可贮于干燥器中备用。薄层表面要求平整,厚薄均匀。②点样。选取制备好的薄板一块,在距1.5 cm底边的直线上选7个点,各点间距2 cm,用调至1 μL的移液枪于各点处分别点上不同的糖样品,样点直径尽量不超过2 mm,前次样点干后才能再次复点,重复3次。③展开。以体积比12.5∶4.5∶5.0∶1.5∶1.5的正丁醇∶甲醇∶氯仿∶冰醋酸∶水为展开剂倒入直径为15 cm的培养皿,将培养皿放入层析缸,待薄层板上样品点自然干燥后,将薄板置于盛有层析溶剂的层折缸中的培养皿中,自下向上展层,当展层溶剂到达离薄板顶端约3 cm 处时取出薄板,前沿作一记号,用吹风机将其吹干。④显色。待薄板吹干后,均匀地喷上一层苯胺-二苯胺溶液显色剂,于85 ℃下显色至斑点清晰,则各糖分别显出各自的颜色。
2 结果与分析
2.1 标准曲线的绘制
以吸光度为横坐标,葡萄糖含量为纵坐标,绘制标准曲线,结果见图1。由图1可以看出,在葡萄糖含量为0.000~0.100 mg/mL 的范围内,葡萄糖含量与吸光度线性关系良好。经线性回归标准曲线方程为Y=0.106 0A+0.000 2,R2=0.999。
2.2 各种方案试验结果
2因素3水平共有9中试验方案,9种试验方案结果见表2。从表2可以看出,在水提温度为100 ℃的条件下,料液比1∶45,提取时间3.5 h,此时多糖提取率为3.99%,而在料液比为1∶55,提取时间为4.0 h的提取率最小为0.61%。
2.3 薄层色谱结果
选择展开剂体积比为12.5∶4.5∶5.0∶1.5∶1.5的正丁醇∶甲醇∶氯仿∶冰醋酸∶水薄层图谱见图2。由图2可以得出,点样线到溶剂前沿的距离为11.5 cm,且已知公式Rf=点样线到斑点中心的距离/点样线到溶剂前沿的距离,则各糖对应的Rf值如下表3。综合考虑可得出桑黄粗多糖的单糖组成接近为D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖和D-乳糖。因薄层色谱影响因素较多,如展开剂、显色剂的选择,显色时,显色剂量的控制等,所以单糖种类确定、精确的单糖组成和含量需进一步运用其他技术进行分析,如气相色谱等。
3 小结与讨论
药用真菌近年来越来越被人们所重视,如桑黄具有极高的药用价值,其中以多糖为主。由于其具有多种功效,因此对多糖的研究已成为医药食品界的热门领域。
由于蒽酮-硫酸法几乎可以测定溶液中所有碳水化合物的含量,所以用该法测出的碳水化合物含量,实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物的总量[11-13]。因此,蒽酮-硫酸法测定结果略高于苯酚-硫酸法,所测结果更为合理准确。
本试验考察了料液比、提取时间2个因素分别对多糖提取率的影响,结合其他考察因素得出最佳的提取条件为:在水提温度为100 ℃的前提下,料液比1∶45,提取时间3.5 h,多糖提取率最高可达3.99%。这个桑黄多糖提取率高于游庆红等[6]的桑黄多糖提取率1.133%、尹秀莲等[13]的桑黄多糖提取率1.46%及秦俊哲等[11]的桑黄子实体多糖提取率3.43%。这个试验用一种比较简单的方法获得了较高的多糖提取率,对于桑黄多糖的工业化提取具有重要的指导意义。
运用薄层色谱法初步确定桑黄菌丝体多糖的单糖组成为D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖和D-乳糖,这与秦俊哲等[11]测定的桑黄子实体多糖的单糖组成为鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖,日本桑黄子实体多糖的单糖组成为鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖具有较大差别,产生不同的原因有品种的原因,也可能因为菌丝体与子实体原材料不同所造成。
参考文献:
[1] IKEKAWA T, NAKANISHI M, VEHARA N, et al. Antitumor action of some basidiomycetes, especially Phellinus linteus[J]. Gann, 1986,59(9):155-157.
[2] 吕英华,王建芳,李玉平,等.药用真菌桑黄的研究进展[J].蚕业科学,2009,35(1):204-210.
[3] SASAKI T,FULII K,SUGURA M,et al. Antitumor polysaccharides from some polyporaceae. Ganderma applanatum(Pers.) Pat and Phellinus linteus Teng[J]. Chem Pharm Bull, 1971, 19(10):821-826.
[4] 王英辉,许泓瑜,敖宗华,等.桑黄发酵菌粉与桑黄子实体成分分析比较[J].食品与发酵工业,2008,34(2):126-129.
[5] 梁大勇,黄 芳,赵 晨,等.桑黄粗多糖除蛋白及抗肿瘤活性[J].生物加工过程,2012,10(3):56-60.
[6] 游庆红,尹秀莲.响应面法优化桑黄多糖提取工艺研究[J].中国酿造,2010(5):67-69.
[7] 逯家辉,董 媛,张益波,等.响应面法优化桑黄菌丝体多糖超声波提取工艺的研究[J].林产化学与工业,2009,29(2):63-68.
[8] 欧阳小丽,张晓昱,王宏勋,等.茶薪菇菌丝体多糖提取方法的研究[J].中国食用菌,2004,23(5):35-37.
[9] KIM G Y,PARK H S,NAM B H.Purification and characterization of acidic proteo-heteroglycan from the fruiting body of Phellinus linteus (Berk. & M.A. Curtis) Teng[J].Bioresource Technology, 2003,89(1):81-86.
[10] 刘晓涵,陈永刚,林 励,等.蒽酮-硫酸法与苯酚-硫酸法测定枸杞中多糖含量的比较[J].食品科技,2009,34(4):270-272.
[11] 秦俊哲,刘 华.桑黄子实体多糖工艺及单糖组成研究[J].中国食用菌,2008,27(6):43-45.
[12] 庄楚强,何春雄.应用数理统计基础[M].第三版.广州:华南理工大学出版社,2009.
[13] 尹秀莲,游庆红.超声辅助复合酶法提取桑黄多糖[J].食品与机械,2011(4):58-60.
1.2.6 桑黄菌丝体多糖成分分析 运用薄层色谱法分析多糖组成成分[11]。
1)精确称取脱蛋白多糖10 mg,10 mg样品中加入5 mL 1 mol/L硫酸,密封试管100 ℃下水解4 h,水解液冷却后加入足量碳酸钡中和,4 500 r/min下离心10 min后收集上清液,沉淀以5 mL 50%乙醇洗涤后再离心,合并上清液。上清液于40 ℃下真空干燥,残渣溶于1 mL去离子水中备用。
同样,精确称定D-葡萄糖3 mg、D-木糖3 mg、 D-半乳糖3 mg、L-阿拉伯糖3 mg、L-鼠李糖3 mg、D-乳糖3 mg各溶于2 mL去离子水中制成对照糖溶液。
2)薄层色谱层析。①硅胶G薄层板。试验前取一块硅胶G板于110 ℃烘箱中活化1 h,取出后即可使用,亦可贮于干燥器中备用。薄层表面要求平整,厚薄均匀。②点样。选取制备好的薄板一块,在距1.5 cm底边的直线上选7个点,各点间距2 cm,用调至1 μL的移液枪于各点处分别点上不同的糖样品,样点直径尽量不超过2 mm,前次样点干后才能再次复点,重复3次。③展开。以体积比12.5∶4.5∶5.0∶1.5∶1.5的正丁醇∶甲醇∶氯仿∶冰醋酸∶水为展开剂倒入直径为15 cm的培养皿,将培养皿放入层析缸,待薄层板上样品点自然干燥后,将薄板置于盛有层析溶剂的层折缸中的培养皿中,自下向上展层,当展层溶剂到达离薄板顶端约3 cm 处时取出薄板,前沿作一记号,用吹风机将其吹干。④显色。待薄板吹干后,均匀地喷上一层苯胺-二苯胺溶液显色剂,于85 ℃下显色至斑点清晰,则各糖分别显出各自的颜色。
2 结果与分析
2.1 标准曲线的绘制
以吸光度为横坐标,葡萄糖含量为纵坐标,绘制标准曲线,结果见图1。由图1可以看出,在葡萄糖含量为0.000~0.100 mg/mL 的范围内,葡萄糖含量与吸光度线性关系良好。经线性回归标准曲线方程为Y=0.106 0A+0.000 2,R2=0.999。
2.2 各种方案试验结果
2因素3水平共有9中试验方案,9种试验方案结果见表2。从表2可以看出,在水提温度为100 ℃的条件下,料液比1∶45,提取时间3.5 h,此时多糖提取率为3.99%,而在料液比为1∶55,提取时间为4.0 h的提取率最小为0.61%。
2.3 薄层色谱结果
选择展开剂体积比为12.5∶4.5∶5.0∶1.5∶1.5的正丁醇∶甲醇∶氯仿∶冰醋酸∶水薄层图谱见图2。由图2可以得出,点样线到溶剂前沿的距离为11.5 cm,且已知公式Rf=点样线到斑点中心的距离/点样线到溶剂前沿的距离,则各糖对应的Rf值如下表3。综合考虑可得出桑黄粗多糖的单糖组成接近为D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖和D-乳糖。因薄层色谱影响因素较多,如展开剂、显色剂的选择,显色时,显色剂量的控制等,所以单糖种类确定、精确的单糖组成和含量需进一步运用其他技术进行分析,如气相色谱等。
3 小结与讨论
药用真菌近年来越来越被人们所重视,如桑黄具有极高的药用价值,其中以多糖为主。由于其具有多种功效,因此对多糖的研究已成为医药食品界的热门领域。
由于蒽酮-硫酸法几乎可以测定溶液中所有碳水化合物的含量,所以用该法测出的碳水化合物含量,实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物的总量[11-13]。因此,蒽酮-硫酸法测定结果略高于苯酚-硫酸法,所测结果更为合理准确。
本试验考察了料液比、提取时间2个因素分别对多糖提取率的影响,结合其他考察因素得出最佳的提取条件为:在水提温度为100 ℃的前提下,料液比1∶45,提取时间3.5 h,多糖提取率最高可达3.99%。这个桑黄多糖提取率高于游庆红等[6]的桑黄多糖提取率1.133%、尹秀莲等[13]的桑黄多糖提取率1.46%及秦俊哲等[11]的桑黄子实体多糖提取率3.43%。这个试验用一种比较简单的方法获得了较高的多糖提取率,对于桑黄多糖的工业化提取具有重要的指导意义。
运用薄层色谱法初步确定桑黄菌丝体多糖的单糖组成为D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖和D-乳糖,这与秦俊哲等[11]测定的桑黄子实体多糖的单糖组成为鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖,日本桑黄子实体多糖的单糖组成为鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖具有较大差别,产生不同的原因有品种的原因,也可能因为菌丝体与子实体原材料不同所造成。
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[8] 欧阳小丽,张晓昱,王宏勋,等.茶薪菇菌丝体多糖提取方法的研究[J].中国食用菌,2004,23(5):35-37.
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[11] 秦俊哲,刘 华.桑黄子实体多糖工艺及单糖组成研究[J].中国食用菌,2008,27(6):43-45.
[12] 庄楚强,何春雄.应用数理统计基础[M].第三版.广州:华南理工大学出版社,2009.
[13] 尹秀莲,游庆红.超声辅助复合酶法提取桑黄多糖[J].食品与机械,2011(4):58-60.
1.2.6 桑黄菌丝体多糖成分分析 运用薄层色谱法分析多糖组成成分[11]。
1)精确称取脱蛋白多糖10 mg,10 mg样品中加入5 mL 1 mol/L硫酸,密封试管100 ℃下水解4 h,水解液冷却后加入足量碳酸钡中和,4 500 r/min下离心10 min后收集上清液,沉淀以5 mL 50%乙醇洗涤后再离心,合并上清液。上清液于40 ℃下真空干燥,残渣溶于1 mL去离子水中备用。
同样,精确称定D-葡萄糖3 mg、D-木糖3 mg、 D-半乳糖3 mg、L-阿拉伯糖3 mg、L-鼠李糖3 mg、D-乳糖3 mg各溶于2 mL去离子水中制成对照糖溶液。
2)薄层色谱层析。①硅胶G薄层板。试验前取一块硅胶G板于110 ℃烘箱中活化1 h,取出后即可使用,亦可贮于干燥器中备用。薄层表面要求平整,厚薄均匀。②点样。选取制备好的薄板一块,在距1.5 cm底边的直线上选7个点,各点间距2 cm,用调至1 μL的移液枪于各点处分别点上不同的糖样品,样点直径尽量不超过2 mm,前次样点干后才能再次复点,重复3次。③展开。以体积比12.5∶4.5∶5.0∶1.5∶1.5的正丁醇∶甲醇∶氯仿∶冰醋酸∶水为展开剂倒入直径为15 cm的培养皿,将培养皿放入层析缸,待薄层板上样品点自然干燥后,将薄板置于盛有层析溶剂的层折缸中的培养皿中,自下向上展层,当展层溶剂到达离薄板顶端约3 cm 处时取出薄板,前沿作一记号,用吹风机将其吹干。④显色。待薄板吹干后,均匀地喷上一层苯胺-二苯胺溶液显色剂,于85 ℃下显色至斑点清晰,则各糖分别显出各自的颜色。
2 结果与分析
2.1 标准曲线的绘制
以吸光度为横坐标,葡萄糖含量为纵坐标,绘制标准曲线,结果见图1。由图1可以看出,在葡萄糖含量为0.000~0.100 mg/mL 的范围内,葡萄糖含量与吸光度线性关系良好。经线性回归标准曲线方程为Y=0.106 0A+0.000 2,R2=0.999。
2.2 各种方案试验结果
2因素3水平共有9中试验方案,9种试验方案结果见表2。从表2可以看出,在水提温度为100 ℃的条件下,料液比1∶45,提取时间3.5 h,此时多糖提取率为3.99%,而在料液比为1∶55,提取时间为4.0 h的提取率最小为0.61%。
2.3 薄层色谱结果
选择展开剂体积比为12.5∶4.5∶5.0∶1.5∶1.5的正丁醇∶甲醇∶氯仿∶冰醋酸∶水薄层图谱见图2。由图2可以得出,点样线到溶剂前沿的距离为11.5 cm,且已知公式Rf=点样线到斑点中心的距离/点样线到溶剂前沿的距离,则各糖对应的Rf值如下表3。综合考虑可得出桑黄粗多糖的单糖组成接近为D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖和D-乳糖。因薄层色谱影响因素较多,如展开剂、显色剂的选择,显色时,显色剂量的控制等,所以单糖种类确定、精确的单糖组成和含量需进一步运用其他技术进行分析,如气相色谱等。
3 小结与讨论
药用真菌近年来越来越被人们所重视,如桑黄具有极高的药用价值,其中以多糖为主。由于其具有多种功效,因此对多糖的研究已成为医药食品界的热门领域。
由于蒽酮-硫酸法几乎可以测定溶液中所有碳水化合物的含量,所以用该法测出的碳水化合物含量,实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物的总量[11-13]。因此,蒽酮-硫酸法测定结果略高于苯酚-硫酸法,所测结果更为合理准确。
本试验考察了料液比、提取时间2个因素分别对多糖提取率的影响,结合其他考察因素得出最佳的提取条件为:在水提温度为100 ℃的前提下,料液比1∶45,提取时间3.5 h,多糖提取率最高可达3.99%。这个桑黄多糖提取率高于游庆红等[6]的桑黄多糖提取率1.133%、尹秀莲等[13]的桑黄多糖提取率1.46%及秦俊哲等[11]的桑黄子实体多糖提取率3.43%。这个试验用一种比较简单的方法获得了较高的多糖提取率,对于桑黄多糖的工业化提取具有重要的指导意义。
运用薄层色谱法初步确定桑黄菌丝体多糖的单糖组成为D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖和D-乳糖,这与秦俊哲等[11]测定的桑黄子实体多糖的单糖组成为鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖,日本桑黄子实体多糖的单糖组成为鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖具有较大差别,产生不同的原因有品种的原因,也可能因为菌丝体与子实体原材料不同所造成。
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