卷柏乙醇提取物对14种植物病原菌的抑制活性

2014-11-20刘霞龚永欢王艳红肖巧玉袁小红马

湖北农业科学 2014年18期

刘霞+龚永欢+王艳红+肖巧玉+袁小红+马林

摘要：采用牛津杯法及琼脂打孔法测定卷柏（Selaginella tamariscina）乙醇提取物对4种植物病原细菌[柑橘溃疡病菌（Xanthomonas carotovora pv.citri）、姜瘟病菌（Ralstonia solanacearum）、水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）、大白菜软腐病菌（Erwinia carotovora pv. carotovora）]的抗菌活性。结果表明，在浓度为1 mg/mL时，卷柏乙醇提取物对4种供试细菌具有较好的抑制活性，抑菌圈直径13.6～15.3 mm，对姜瘟病菌和水稻白叶枯病菌的最低抑菌浓度为125 μg/mL。采用生长速率法测定提取物对10种植物病原真菌[香蕉酸腐病菌（Geotrichum candidum Link ex Pers）、苹果轮纹病菌（Physalospora nasei）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum）、苹果腐烂病菌（Valsa mali）、玉米小斑病菌（Helminthosporium maydwas）、葡萄黑痘病菌（Sphaceloma ampelinum）、苹果斑点落叶病菌（Alternarial ternate f.sp.mali）、棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum）、番茄棉腐病菌（Pythium ultimum）]的抑制作用，发现除对苹果轮纹病菌的抑制效果较好外（抑制率为56.3%），对其余供试菌的抑制率均低于50%。

关键词：卷柏（Selaginella tamariscina）；提取物；植物病原菌；抑菌活性

中图分类号：R 285.5；Q946.887；S482.2+92 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）18-4320-04

卷柏（Selaginella tamariscina）为蕨类植物门卷柏科（Selaginellaceae）卷柏属（Selaginella）植物[1]。卷柏属植物含有黄酮类化合物、酚类化合物及多糖类物质等化学活性成分[2，3]。已有研究发现，卷柏具有抗病毒[4]、降糖[5]、抗氧化[6]、抗肿瘤[7]及舒张血管[8]等药理活性。关于卷柏提取物及化学成分的抑菌活性已有报道，周仁超等[9]研究发现兖州卷柏（Selaginella involvens Spring）水提物对变形杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌和痢疾杆菌有一定的抑菌作用。鲁曼霞等[2]报道兖州卷柏穗花杉双黄酮、β-D-glucopyranoside-（3β）-cholest-5-en-3yl和β-香树脂醇对肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌具有不同的抑制效果，韩国学者Jung等[10]研究了卷柏（Selaginella tamansina）穗花杉双黄酮对几种真菌的抑制效应，发现对酿酒酵母菌、黄曲霉、白色念珠菌、白吉利毛孢子菌具有较好的抑制活性。还有研究[11，12]发现卷柏多糖及炔酚类化合物对动植物病原菌也具有抑制活性。研究卷柏及其有效成分对植物病原菌的抑制作用的报道较为少见，陈晓清等[11]报道卷柏多糖对甘薯薯瘟病菌、玉米大斑病菌、稻瘟病菌、甘蔗黑穗病菌、烂尾病菌有抑制效应。本研究针对14种常见的农作物病原细菌与真菌，测定卷柏乙醇提取物对其的抑制作用，目的在于丰富卷柏的抑菌作用谱，探索其作为植物源杀菌剂的潜力。

1 材料与方法

1.1 卷柏及乙醇提取物

卷柏干燥全草购自绵阳本地中药材公司，经绵阳师范学院罗明华教授鉴定。卷柏样品粉碎，用95%乙醇80 ℃回流提取3次（料液比10∶1），合并提取液，减压浓缩后用石油醚脱脂，40 ℃烘干得卷柏乙醇提取物。

1.2 供试菌种

细菌：柑橘溃疡病菌（Xanthomonas Campestris pv.citri），姜瘟病菌（Ralstonia solanacearum），水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae），大白菜软腐病菌（Erwinia carotovora pv. carotovora），由四川大学农药与作物保护研究所提供。

真菌：香蕉酸腐病菌（Geotrichum candidum Link ex Pers），苹果轮纹病菌（Physalospora nasei），油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum），小麦赤霉病菌（Fusarium graminearum），苹果腐烂病菌（Valsa mali），玉米小斑病菌（Helminthosporium maydwas），葡萄黑痘病菌（Sphaceloma ampelinum），苹果斑点落叶病菌（Alternarial ternate f.sp.mali），棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum），番茄棉腐病菌（Pythium ultimum），由西南科技大学生物科学实验中心保存。

1.3 供试药液

卷柏乙醇提取物用1% NaOH溶解并配制成浓度为1 mg/mL的母液，将母液按倍数稀释法配成浓度为0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/mL的供试液，置于4 ℃冰箱备用。

将青霉素钠用20%甲醇溶解配成0.5 mg/mL的母液，将母液按倍数稀释法配成浓度为0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 mg/mL的溶液，置于4 ℃冰箱备用。

1.4 菌种活化

1.4.1 细菌活化采用液体牛肉膏蛋白胨培养基[13] 将冰箱保存的细菌菌种分别接一环于20 mL灭菌的液体牛肉膏蛋白胨培养基中，37 ℃恒温培养箱内培养18～24 h。

1.4.2 真菌活化采用PDA培养基[13] 接种真菌的菌饼（直径6 mm）于20 mL PDA平板培养基中心，28 ℃恒温培养箱内培养，直至菌丝长满整个培养皿。

1.5 抑制细菌活性测定

采用牛津杯法测定卷柏乙醇提取物对4种植物病原细菌的抑制效应，参考刘健等[14]的方法并略作改动。倒好平板并冷却，吸取菌悬液0.2 mL置于平板培养基上并涂布均匀。静置5 min后每板等距放入5个牛津杯，其中3个牛津杯加入0.2 mL的提取物母液，其余两个分别加入0.2 mL的1% NaOH溶液和0.2 mL 的0.5 mg/mL 青霉素钠溶液，分别作为阴性对照和阳性对照。每菌种重复3次。于37 ℃培养48 h后测定抑菌圈大小。

采用打孔法测定卷柏乙醇提取物对4种植物病原细菌的最低抑菌浓度（MIC），参考曾维才等[15]的方法并略作改动。吸取1 mL菌悬液于培养皿中，加入24 mL 牛肉膏蛋白胨培养基（45～50 ℃），使菌液与培养基充分混匀，静置冷却。用直径6 mm打孔器打孔，分别加入提取物的不同浓度供试液100 μL。于37 ℃培养48 h后观察抑菌情况，以抑菌圈直径为7 mm及以上的供试液浓度作为最低抑菌浓度。青霉素钠阳性对照采用同样方法测定其MIC。

1.6 抑制真菌活性测定

采用生长速率法[16]测定卷柏的乙醇提取物对10种植物病原真菌的抑制作用。吸取1 mL浓度为1 mg/mL的提取液于培养皿中，加入24 mL PDA培养基（45～50 ℃），充分混匀，静置冷却。接种活化的真菌菌饼（直径6 mm）于培养皿中心。空白对照接种同样的菌饼，但不加待测液。每一菌种及空白对照均设3次重复。于28 ℃恒温培养3～8 d，每24 h观察1次，待空白对照的菌丝长满培养皿时，用十字交叉法测量各菌落生长直径，计算抑制率。

1.7 数据统计与分析

数据采用DPS 7.05数据分析软件进行统计分析，差异显著性分析采用最小显著差异法（LSD法）。

2 结果与分析

2.1 卷柏乙醇提取物对4种植物病原细菌的抑制作用

采用牛津杯法测定卷柏的乙醇提取物对4种病原细菌的抑制活性，结果见表1。在供试浓度为1 mg/mL时，乙醇提取物对姜瘟病菌、柑橘溃疡病菌、大白菜软腐病菌的抑菌圈直径均超过15 mm，而对水稻白叶枯病菌的抑菌圈为13.6 mm，统计分析表明4个菌种间均差异不显著（p<0.05）。

最低抑菌浓度测定结果（表2）表明，乙醇提取物对姜瘟病菌和水稻白叶枯病菌的MIC均为125 μg/mL，而对大白菜软腐病菌和柑橘溃疡病菌的MIC均为250 μg/mL。青霉素钠阳性对照的MIC明显低于卷柏提取物，对姜瘟病菌、水稻白叶枯病菌、大白菜软腐病菌的MIC均为12.5 μg/mL，对柑橘溃疡病的MIC均为25 μg/mL。

2.2 卷柏乙醇提取物对植物病原真菌的抑制作用

采用生长速率法测定卷柏乙醇提取物对10种植物病原真菌的抑制作用，结果（表3）表明，在浓度为1 mg/mL时，乙醇提取物对所有供试真菌的抑制作用均较弱，抑制率最高的仅56.3%（苹果轮纹病菌），对其余9种真菌的抑制率均低于50%。

3 小结与讨论

研究发现卷柏乙醇提取物对柑橘溃疡病菌、姜瘟病菌、水稻白叶枯病菌和大白菜软腐病菌具有较好的抑制作用（抑菌圈直径为13.6～15.3 mm），与陈晓清等[11]采用滤纸片法测定卷柏多糖抑制甘薯薯瘟病菌的结果相似（抑菌圈直径为14.8 mm），而周仁超等[9]采用滤纸片法测定，发现兖州卷柏水提物对变形杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、痢疾杆菌的抑制作用在不同菌种间差异较大（抑菌圈直径为9～28 mm）。根据NCCLS推荐标准[17]，4种供试细菌对卷柏乙醇提取物的敏感性为中敏至高敏。

从最低抑菌浓度测定结果看，卷柏乙醇提取物对4种供试细菌的MIC为125～250 μg/mL，而从兖州卷柏中分离的穗花杉双黄酮和β-香树脂醇对肺炎链球菌以及β-D-glucopyranoside-（3β）-cholest-5-en-3yl对金黄色葡萄球菌则具有极好的抑制作用（MIC为16 μg/mL）[2]。Cao等[12]的研究也发现卷柏中3个新型炔酚类化合物对金黄色葡萄球菌有很强抑制活性（MIC低于10 μg/mL）。这表明从卷柏乙醇提取物中可以进一步分离获得具有很好抑制植物病原细菌的活性物质。

卷柏中的黄酮类、酚类化合物及多糖物质可能对细菌的生长起到抑制作用，其作用机制可能是抑制细菌核酸合成、影响细菌细胞膜的结构与透性或抑制细胞能量代谢[18，19]。

本研究结果表明，卷柏乙醇提取物对植物病原真菌的抑制效果较弱，抑制率最高仅为56.3%，这可能与提取物中抑菌有效成分含量较低有关。若对乙醇提取物进一步分离纯化，提高其有效成分含量，或分离获得穗花杉双黄酮等活性物质，可能会有更好的抑制真菌效果。研究已经发现卷柏穗花杉双黄酮对酿酒酵母菌、白色念珠菌具有很强的抑制作用（MIC为5 μg/mL）[10]，卷柏多糖对甘薯薯瘟病菌、绿色木霉和肠炎病菌也具有较好的抑制活性（MIC为6.25 mg/mL）[11]。这说明卷柏中存在对部分真菌具有很好抑制效果的活性物质，因此后续研究可对卷柏乙醇提取物进行分离纯化，进一步研究其对供试真菌的抑制效果或扩大抑菌作用筛选范围，以确定卷柏抑制植物病原真菌的潜力。

参考文献：

[1] 贺光东.卷柏活性成分研究[D].河南开封：河南大学.2009.

[2] 鲁曼霞，黄可龙，施树云，等.兖州卷柏化学成分及体外抗菌活性研究[J].天然产物研究与开发，2009，21（6）：973-975.

[3] YANG S F， CHU S C， LIU S J， et al. Antimetastatic activities of Selaginella tamariscina （Beauv.） on lung cancer cells in vitro and in vivo[J]. J Ethnopharmacol， 2007， 110（3）：483-489.

[4] MA S C， HE Y H， VINCENT E O， et al.Antiviral amento-avone from Selaginella sinensis[J]. Biol Pharm Bull， 2001， 24（3）：311-312.

[5] ZHENG X K， LI Y J， LI Z， et al. Antihyperglycemic activity of Selaginella tamariscina（Beauv.） Spring[J]. J Ethnopharmacol，2011，133（2）：531-537.

[6] 徐智，贾素洁，谭桂山，等.垫状卷柏中双黄酮药理活性的研究[J].中国现代医学杂志，2004，14（14）：88-89.

[7] 孙颖桢.3种卷柏属药用植物抗肿瘤作用的实验研究[D].武汉：湖北中医药大学，2008.

[8] 许兰，尹明浩.卷柏穗花杉双黄酮的舒张血管作用实验研究[J].延边大学医学学报，2009，32（4）：246-248.

[9] 周仁超，李淑彬.蕨类植物抗菌作用的初步研究[J].湖南中医药导报，1999，11（4）：13-14.

[10] JUNG H J， SUNG W S， YEO S H， et al. Antifungal effect of amentoflavone derived from Selaginella tamariscina[J]. Arch Pharm Res，2006，29（9）：746-751.

[11] 陈晓清，苏育才，陈郑镔.抗菌卷柏多糖的提取与分离[J] .亚热带农业研究，2009，5（2）：98-101.

[12] CAO Y， CHEN J J， TAN N H，et al. Anitimicrobial selaginellinderivative from Selaginell apulvinata[J]. Bioorg Med Chem Lett，2010，20（8）：2456-2460.

[13] 张玲.微生物学实验指导[M].北京：北京交通大学出版社，2007.

[14] 刘健，王海雁，赵淑江.牛津杯法测定五倍子对大黄鱼病原弧菌的体外抑菌活力[J].海洋科学，2009，33（11）：44-47.

[15] 曾维才，谭敏，张佳琪.不同抑菌方法在食品防腐剂效果评价方面的比较[J].食品安全质量检测学报，2010，27（3）：112-117.

[16] 杨顺义，郭东艳，沈慧敏，等.苍耳等14种植物对植物病原菌的抑菌活性[J].植物保护，2006，32（3）：68-71.

[17] 李雅军，张斌，王华.2006年CLSI/NCCLS药敏标准的更新（CLSI/NCCLS M100-S16代替M100-S15）[J].江西医学检验，2006，24（4）：355-356.

[18] CUSHNIE T P， LAMB A J. Antimicrobial activity of flavonoids[J]. Inter J Antimicro Agents，2005，26（5）：343-356.

[19] 玄红专，胡福良.黄酮类化合物抑制微生物活性及其作用机制[J].天然产物研究与开发，2010，22（1）：171-175.