基于酶抑制原理的电喷雾质谱法快速筛查蔬菜中氨基甲酸酯类农药残留

罗辉泰　黄晓兰　吴惠勤　张立　郭寅龙　朱志鑫　黄芳　林晓珊

摘要采用电喷雾质谱（ESIMS），通过测定乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase， AChE）的抑制率，建立了蔬菜中氨基甲酸酯类农药（Carbamate pesticides， CBPs）残留的快速筛查方法。样品经QuEChERS方法简单处理后，以硫代乙酰胆碱为底物，与AChE发生酶促反应，用ESIMS法测定底物转化成产物硫代胆碱的转化率， 进而计算得到AChE的抑制率。本实验优化了酶促反应温度、时间及浓度等条件，考察了10种常见CBPs农药浓度与AChE抑制率的关系，研究了实际蔬菜样品存在的基质效应，以不含农药的空白蔬菜样品的酶抑制率的3倍确立了方法的检出限。结果表明，方法检出限可达到0.01～0.05 mg/kg，优于现行的农药残留快速筛查国家标准，完全满足食品安全国家标准对食品中农药最大残留限量的要求，且具有良好的抗基质干扰能力，可有效避免假阳性结果的出现，并通过了液相色谱串联质谱法的验证。本方法简便快速、灵敏可靠，适用于蔬菜中氨基甲酸酯类农药的快速、高通量筛查。关键词酶抑制； 电喷雾质谱； 蔬菜； 氨基甲酸酯类农药； 快速筛查； 高通量

氨基甲酸酯类农药（CBPs）自问世以来，因其具有选择性强、杀虫谱广等特点＼[1＼]，被广泛用于防治植物病虫害，对提高农作物产率，促进农业经济发展起到非常重要的作用。但近年来，由于氨基甲酸酯类农药的长期使用、滥用或超量使用，导致蔬菜水果等植物源性食品中残留农药超标严重，由此而造成的农药急慢性中毒事件时有发生。这类农药通过抑制体内乙酰胆碱酯酶（AChE）的活性，使其不能分解乙酰胆碱（ACh）而导致组织中乙酰胆碱过量蓄积，引起人体中枢神经系统症状甚至导致死亡＼[2＼]。为了避免此类中毒事件的发生和实现农产品中残留农药的有效监测，建立蔬菜水果中快速、灵敏的氨基甲酸酯类农药检测方法显得异常迫切。

目前，已有许多分析方法用于氨基甲酸酯类农药残留的检测，如生物传感器[3]、液相色谱法＼[4，5＼]、气相色谱法＼[6＼]、气相色谱质谱法＼[7＼]及液相色谱串联质谱法＼[8～10＼]等。由于大多数CBPs属于难挥发化合物，气相色谱法或气相色谱质谱法只能检测少数几种CBPs； 对于基质复杂的样品，液相色谱法的灵敏度和可靠性均难以达到要求； 而最适宜分析CBPs的液相色谱串联质谱法，其分析时间也较长，且需要提供目标农药标准品做对照，无法实现快速高通量测试。

氨基甲酸酯类农药的快速检测方法是基于CBPs对AChE抑制的原理。AChE具有催化乙酰胆碱水解成胆碱的作用，过程如图1所示，而一旦CBPs与其结合，将使其失去催化反应能力。因而，CBPs的残留可以通过AChE活性被抑制的情况间接进行测定。目前，基于此原理测定农残的方法主要有速测卡法＼[11＼]、分光光度法＼[12，13＼]、pH法＼[13＼] 、酶生物传感器法＼[14＼]。然而，前3种方法灵敏度过低，且极易受样品基质干扰而出现假阳性结果； 酶生物传感器法虽然其灵敏度较高，但步骤多且繁琐。与现有方法相比，质谱仪因具有快速、准确、灵敏、抗基质干扰能力强等多方面优势，已开始用于酶活测定。如Xu等＼[15＼]采用基质辅助激光解析离子化傅立叶变换质谱（MALDIFTMS），通过测定AChE底物及其产物的含量实现了酶活的测定，建立了基于此技术的有机磷农药筛查方法＼[16～18＼]，这种方法具有快速、高通量、高灵敏度的优势，但由于MALDIFTMS仪器成本高昂，普及率低，方法难以推广应用。另外，目前还未见基于此原理的质谱法测定氨基甲酸酯类农药的报道。本实验采用已较为普及的电喷雾质谱（ESIMS），建立基于酶抑制原理的快速筛查蔬菜中氨基甲酸酯类农药残留的新方法，该法在满足快速、灵敏、高通量要求的同时，大大降低了筛查成本，便于方法的推广应用。迄今为止，采用ESIMS，通过测定AChE活性，快速筛查CBPs的方法尚未见报道。

摘要采用电喷雾质谱（ESIMS），通过测定乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase， AChE）的抑制率，建立了蔬菜中氨基甲酸酯类农药（Carbamate pesticides， CBPs）残留的快速筛查方法。样品经QuEChERS方法简单处理后，以硫代乙酰胆碱为底物，与AChE发生酶促反应，用ESIMS法测定底物转化成产物硫代胆碱的转化率， 进而计算得到AChE的抑制率。本实验优化了酶促反应温度、时间及浓度等条件，考察了10种常见CBPs农药浓度与AChE抑制率的关系，研究了实际蔬菜样品存在的基质效应，以不含农药的空白蔬菜样品的酶抑制率的3倍确立了方法的检出限。结果表明，方法检出限可达到0.01～0.05 mg/kg，优于现行的农药残留快速筛查国家标准，完全满足食品安全国家标准对食品中农药最大残留限量的要求，且具有良好的抗基质干扰能力，可有效避免假阳性结果的出现，并通过了液相色谱串联质谱法的验证。本方法简便快速、灵敏可靠，适用于蔬菜中氨基甲酸酯类农药的快速、高通量筛查。关键词酶抑制； 电喷雾质谱； 蔬菜； 氨基甲酸酯类农药； 快速筛查； 高通量

氨基甲酸酯类农药（CBPs）自问世以来，因其具有选择性强、杀虫谱广等特点＼[1＼]，被广泛用于防治植物病虫害，对提高农作物产率，促进农业经济发展起到非常重要的作用。但近年来，由于氨基甲酸酯类农药的长期使用、滥用或超量使用，导致蔬菜水果等植物源性食品中残留农药超标严重，由此而造成的农药急慢性中毒事件时有发生。这类农药通过抑制体内乙酰胆碱酯酶（AChE）的活性，使其不能分解乙酰胆碱（ACh）而导致组织中乙酰胆碱过量蓄积，引起人体中枢神经系统症状甚至导致死亡＼[2＼]。为了避免此类中毒事件的发生和实现农产品中残留农药的有效监测，建立蔬菜水果中快速、灵敏的氨基甲酸酯类农药检测方法显得异常迫切。

目前，已有许多分析方法用于氨基甲酸酯类农药残留的检测，如生物传感器[3]、液相色谱法＼[4，5＼]、气相色谱法＼[6＼]、气相色谱质谱法＼[7＼]及液相色谱串联质谱法＼[8～10＼]等。由于大多数CBPs属于难挥发化合物，气相色谱法或气相色谱质谱法只能检测少数几种CBPs； 对于基质复杂的样品，液相色谱法的灵敏度和可靠性均难以达到要求； 而最适宜分析CBPs的液相色谱串联质谱法，其分析时间也较长，且需要提供目标农药标准品做对照，无法实现快速高通量测试。

氨基甲酸酯类农药的快速检测方法是基于CBPs对AChE抑制的原理。AChE具有催化乙酰胆碱水解成胆碱的作用，过程如图1所示，而一旦CBPs与其结合，将使其失去催化反应能力。因而，CBPs的残留可以通过AChE活性被抑制的情况间接进行测定。目前，基于此原理测定农残的方法主要有速测卡法＼[11＼]、分光光度法＼[12，13＼]、pH法＼[13＼] 、酶生物传感器法＼[14＼]。然而，前3种方法灵敏度过低，且极易受样品基质干扰而出现假阳性结果； 酶生物传感器法虽然其灵敏度较高，但步骤多且繁琐。与现有方法相比，质谱仪因具有快速、准确、灵敏、抗基质干扰能力强等多方面优势，已开始用于酶活测定。如Xu等＼[15＼]采用基质辅助激光解析离子化傅立叶变换质谱（MALDIFTMS），通过测定AChE底物及其产物的含量实现了酶活的测定，建立了基于此技术的有机磷农药筛查方法＼[16～18＼]，这种方法具有快速、高通量、高灵敏度的优势，但由于MALDIFTMS仪器成本高昂，普及率低，方法难以推广应用。另外，目前还未见基于此原理的质谱法测定氨基甲酸酯类农药的报道。本实验采用已较为普及的电喷雾质谱（ESIMS），建立基于酶抑制原理的快速筛查蔬菜中氨基甲酸酯类农药残留的新方法，该法在满足快速、灵敏、高通量要求的同时，大大降低了筛查成本，便于方法的推广应用。迄今为止，采用ESIMS，通过测定AChE活性，快速筛查CBPs的方法尚未见报道。

摘要采用电喷雾质谱（ESIMS），通过测定乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase， AChE）的抑制率，建立了蔬菜中氨基甲酸酯类农药（Carbamate pesticides， CBPs）残留的快速筛查方法。样品经QuEChERS方法简单处理后，以硫代乙酰胆碱为底物，与AChE发生酶促反应，用ESIMS法测定底物转化成产物硫代胆碱的转化率， 进而计算得到AChE的抑制率。本实验优化了酶促反应温度、时间及浓度等条件，考察了10种常见CBPs农药浓度与AChE抑制率的关系，研究了实际蔬菜样品存在的基质效应，以不含农药的空白蔬菜样品的酶抑制率的3倍确立了方法的检出限。结果表明，方法检出限可达到0.01～0.05 mg/kg，优于现行的农药残留快速筛查国家标准，完全满足食品安全国家标准对食品中农药最大残留限量的要求，且具有良好的抗基质干扰能力，可有效避免假阳性结果的出现，并通过了液相色谱串联质谱法的验证。本方法简便快速、灵敏可靠，适用于蔬菜中氨基甲酸酯类农药的快速、高通量筛查。关键词酶抑制； 电喷雾质谱； 蔬菜； 氨基甲酸酯类农药； 快速筛查； 高通量

氨基甲酸酯类农药（CBPs）自问世以来，因其具有选择性强、杀虫谱广等特点＼[1＼]，被广泛用于防治植物病虫害，对提高农作物产率，促进农业经济发展起到非常重要的作用。但近年来，由于氨基甲酸酯类农药的长期使用、滥用或超量使用，导致蔬菜水果等植物源性食品中残留农药超标严重，由此而造成的农药急慢性中毒事件时有发生。这类农药通过抑制体内乙酰胆碱酯酶（AChE）的活性，使其不能分解乙酰胆碱（ACh）而导致组织中乙酰胆碱过量蓄积，引起人体中枢神经系统症状甚至导致死亡＼[2＼]。为了避免此类中毒事件的发生和实现农产品中残留农药的有效监测，建立蔬菜水果中快速、灵敏的氨基甲酸酯类农药检测方法显得异常迫切。

目前，已有许多分析方法用于氨基甲酸酯类农药残留的检测，如生物传感器[3]、液相色谱法＼[4，5＼]、气相色谱法＼[6＼]、气相色谱质谱法＼[7＼]及液相色谱串联质谱法＼[8～10＼]等。由于大多数CBPs属于难挥发化合物，气相色谱法或气相色谱质谱法只能检测少数几种CBPs； 对于基质复杂的样品，液相色谱法的灵敏度和可靠性均难以达到要求； 而最适宜分析CBPs的液相色谱串联质谱法，其分析时间也较长，且需要提供目标农药标准品做对照，无法实现快速高通量测试。

氨基甲酸酯类农药的快速检测方法是基于CBPs对AChE抑制的原理。AChE具有催化乙酰胆碱水解成胆碱的作用，过程如图1所示，而一旦CBPs与其结合，将使其失去催化反应能力。因而，CBPs的残留可以通过AChE活性被抑制的情况间接进行测定。目前，基于此原理测定农残的方法主要有速测卡法＼[11＼]、分光光度法＼[12，13＼]、pH法＼[13＼] 、酶生物传感器法＼[14＼]。然而，前3种方法灵敏度过低，且极易受样品基质干扰而出现假阳性结果； 酶生物传感器法虽然其灵敏度较高，但步骤多且繁琐。与现有方法相比，质谱仪因具有快速、准确、灵敏、抗基质干扰能力强等多方面优势，已开始用于酶活测定。如Xu等＼[15＼]采用基质辅助激光解析离子化傅立叶变换质谱（MALDIFTMS），通过测定AChE底物及其产物的含量实现了酶活的测定，建立了基于此技术的有机磷农药筛查方法＼[16～18＼]，这种方法具有快速、高通量、高灵敏度的优势，但由于MALDIFTMS仪器成本高昂，普及率低，方法难以推广应用。另外，目前还未见基于此原理的质谱法测定氨基甲酸酯类农药的报道。本实验采用已较为普及的电喷雾质谱（ESIMS），建立基于酶抑制原理的快速筛查蔬菜中氨基甲酸酯类农药残留的新方法，该法在满足快速、灵敏、高通量要求的同时，大大降低了筛查成本，便于方法的推广应用。迄今为止，采用ESIMS，通过测定AChE活性，快速筛查CBPs的方法尚未见报道。