云南省中医药治疗艾滋病生物样本库的建立与管理*

宋娜丽， 杨玉琪， 赵 远， 乔金丽， 汪林芬， 张媛

(1.云南省中医中药研究院， 云南 昆明 650223； 2.大理学院， 云南 大理 671000)

生物样本库(Biobank)也称生物信息库或生物材料和数据库，指的是长期保存的人体材料和样本，这些样本可与个人数据及有关它们供者的信息相联系或没有联系。人体组织的样本包括细胞、组织和血液以及作为遗传信息物质的DNA。经济合作与发展组织(OECD)定义为：生物样本库是一种集中保存各种人类生物材料(Human biological material)，用于疾病的临床治疗和生命科学研究的生物应用系统。云南省是我国艾滋病的高发区，感染者具有多民族、多途径感染的特点，使云南省艾滋病感染者防治的研究颇具代表性。自2005年云南省中医药治疗艾滋病试点项目开展以来，截止2014年2月底，已累计治疗感染者11806例，正在治疗6791例。规范管理并长期保存依从性好、治疗有效的感染者标本，为我省、乃至全国科研工作者提供有价值的样本，是本院工作人员考虑的工作重点之一。本研究将以“珍惜样本、执行标准、充分应用、维护产权”为原则和宗旨[1]，初步建立云南省中医药治疗艾滋病生物样本库，并实施信息化管理。

1 材料与方法

1.1 材料 海尔-80℃冰箱，金凤牌YDS-50B-125型液氮罐，贝克曼血球计数仪、生物安全柜、超净工作台、离心机、德国产2 mL冻存管，冻存管盒、淋巴细胞分离液、胎牛血清、DMSO、PBS、抗凝、促凝采血管，采血针等。

1.2 标本的采集、分装

1.2.1 全血：按照血液采集标准操作规程(下同)，取2 mL抗凝全血直接分装于冻存管，1管/人。置入-20℃冰箱，过夜转入-80℃。

1.2.2 血清、血浆、白细胞、红细胞 分别取促凝管和抗凝管采4～6 mL全血，2200 rpm/min水平离心10 min，无菌移液器分别吸出血清、血浆、抗凝管中间白细胞层以及下层红细胞，分别装入冻存管中，1.5 mL/管，1～2管/人。

1.2.3 外周血单核细胞(PBMC) 离心后的抗凝全血，取血浆保存后，将剩余血细胞用PBS缓冲液按1：1等倍稀释，轻吹使其充分混匀后，缓缓加入有淋巴细胞分离液的离心管。加入时离心管倾斜45度角，用软吸管先浸润离心管壁，在距分离液上方1 cm处，使稀释液重叠于分层液之上(加入时勿破坏液面，并保持两界面清晰，勿冲破淋巴细胞分离液界面)，水平离心机2200 rpm/min离心20 min，用无菌吸管吸取白细胞层，置另一15 mL离心管中，重复洗3次。血球计数仪计数细胞，加细胞冻存液保存于冻存管。

1.3 样本保存 所有保存样本依据编号规则确定唯一编号后，放入冻存盒置-20℃冰箱过夜，再转入-80℃，整理后放液氮罐长期保存。PBMC最好采用程序性降温盒降温后置液氮罐保存，可大大提高细胞冻存的存活率。

2 结果

本研究已收集中医药治疗1年以上且有效的艾滋病血液标本共50余例，近300份，并收集血液样本捐赠者基本信息及历次生化、血常规、CD4和病毒载量等检测结果，可用于云南省中医药治疗艾滋病药物作用靶点等相关研究，熟悉云南省中医药治疗艾滋病血液样本库的建立与信息化管理，自血液样本库建立以来，各环节正常运行。

3 知情同意

知情同意[2～3]是建立血液样本库过程中遇到的最重要的法律和伦理学问题，它是保证受试者或者血液捐赠者了解并理解试验或研究的目的和内容，自愿同意参加试验或研究、有权知道研究结果、并有权随时放弃参加研究的一种书面同意书。这也是对所有进行人体研究或人体取样调查的研究人员的伦理学要求。在以人为试验或研究对象的领域，研究人员必须获得知情同意，使受试者或者血液捐赠者的利益和权利得到保护，同时，这也是对研究人员的保护。

本项研究方案已通过相关医学伦理委员会的审查和批准，在知情同意书中分析了血样捐赠者的风险和不适，明确了权利、职责和隐私保护问题。

4 质量控制

质量控制[4]是建立艾滋病血液样本库的关键环节。给其他科研课题提供有质量保证的样本是减少物资、人力浪费和避免重复研究的重要途径。为保证血液样本质量应注意以下几点：1.制定并严格遵守质量控制体系文件。2.从血样采集、分装、运输到保存等各个环节，都应严格按照标准操作规程操作。3.尽量缩短从血样采集到保存的时间，血样分装应在生物安全柜进行，PBMC的分离操作严格按照无菌操作条件进行。4.严密监控冰箱、液氮罐等冻存容器的工作状况，确保正常运行。5.标本的使用应合理、谨慎，在物尽其用的前提下，减少反复冻融次数，避免血样浪费。

5 信息化管理[5]

建立并使用冻存标本管理系统，可有效长期、大量保存血液标本，信息化管理有以下特点：1.可添加多级目录，便于对冻存罐所属的小组或部门进行更好管理。2.可形象而生动的表示冻存管位置和当前冻存情况，令管理者和冻存人员对当前冻存状况一目了然。3.可为每管样本或细胞添加多张图片，实现真正的图文管理。4.既可以图文方式打印单管样本记录，也可通过查找功能导出自己所需要的细胞冻存记录，并导出至Excel文件中，方便统计、总结等工作。5.具备查找功能。可按照查找范围、细胞名称、冻存日期、复苏日期、冻存者、复苏者、备注等条件进行查找，同时也可以选择导出至Excel文件。

6 生物安全[6]

6.1 管理体系 根据国务院《病原微生物实验室生物安全管理条例》的规定和《实验室生物安全通用要求》(GB19489-2008)的要求，在省卫生厅的领导和支持下，成立了由单位法人为第一负责人的生物安全管理领导小组。单位血液样本库团队由实验室分管领导、实验室业务骨干、检验技术人员、中医药治疗艾滋病研究人员和护理人员组成，经过专业培训和学习，从事相关业务工作4年以上，具有较强的生物安全意识。

6.2 管理制度

6.2.1 为确保生物安全，制定了严格的管理制度，包括适用于本单位的《实验室生物安全管理手册》和一系列的实验室生物安全体系文件。

6.2.2 因本单位承担着云南省中医药治疗艾滋病的部分患者血液检测工作，故艾滋病血液样本库区采取出入库血液样本交接、审核、登记制度和双人双锁的保管制度，严把库区门户安全。

6.2.3 对入库标本进行严格的登记和到期销毁制度。详细登记血液样本捐赠者信息：姓名、性别、出生日期、采集日期、采集单位等，明确标记样本类型信息：全血(BB)、血清(BS)、血浆(BP)、白细胞(BW)、红细胞(BE)、外周血单核细胞(PBMC)以及样本量和编号。样本交接单应注明样本运输过程中异常状况等。

6.3 预防措施 已经向上级主管部门递交《云南省病原微生物实验室备案登记表》，成立实验室突发事件应急预案管理程序，防止样本丢失、暴力恐怖及自然灾害等因素危及实验室和血液样本的生物安全。

7 讨论

目前，大多学者认为生物样本库对于促进医学研究、医学人文、探究疾病的本质及演变规律、更好的预防和治疗疾病有着重要意义。国内外生物样本库已逐渐向标准化、规范化、专业化、特色化、信息化、国际化、职能化方向发展，美国和欧洲的样本库起步较早，成立了专业性、非营利性的组织库协会，并制定相应的协会标准，经考核合格并取得能力认证证书的人员才能参与组织库的工作。随着基因组学和蛋白组学的发展和人们对生物医学资源认识的提高，国内外已形成了肿瘤库、骨库、眼库、胚胎库、干细胞库等专业化的样本库，国内医疗机构虽然在肿瘤库等方面和国外合作，建立了自己的样本库，但因客观和意识的差距，仍不够完善。提高医疗机构和科研人员利用生物医学资源的意识是关键，对于有特定研究价值的血液、组织、器官及相关医学信息都是样本库收集范围，只要有低温存储设备和厂房，许多医疗机构都可以组建有地区特色、有病种特色的样本库，为地方病的防治和我国原创药物的研发创建良好的平台[6]。

自从2005年云南省中医中药研究院开展中医药治疗艾滋病试点项目以来，对艾滋病血液样本的采集、保存和处理一直依据生物安全等要求采取谨慎的态度，但未建立起规范的科研型血液样本库，未采取有效的长期保存样本的方法，致使科研人员不能对长期治疗患者进行纵向追溯研究，许多有价值的样本无法充分利用，浪费了大量样本资源。科学、规范管理云南省中医药治疗艾滋病血液样本，将为艾滋病的基础和临床研究提供宝贵的实物资源和病例信息共享资源，为探索中医药有效治疗艾滋病的作用靶点和作用规律、实现样本最大限度的开发利用提供良好的平台，也将一定程度的实现陈赛娟院士所说的将试点项目检测后的血液样本“变废土为黄金”[2]，以后笔者会继续完善中医药治疗艾滋病样本库，将DNA、RNA提取物及病理组织等纳入收集范围[7]，为云南省中医药治疗艾滋病的研究、医疗技术、生物技术产业的发展起到促进作用。

参考文献：

[1]张小燕.中国医药生物技术协会组织生物样本库分会成立大会会议纪要，中国医药生物技术，2010，5(1)：76.

[2]刘闵，翟晓梅，邱仁宗.生物信息库的知情同意问题[J].中国医学伦理学，2009，22(2)：31-33.

[3]S.G.Shirley，C.H.P.Durst，C.C.Fuchs，et al.A large-scale cryoelectronic system for biological sample banking[J].cryogenics，2009，49：638-642.

[4]赵娟，李锋，李思源，等.生物样本库的建立与管理[J].现代生物医学进展，2010，10(5)：999-1000.

[5]丛宪玲，孙然，王涵，等.国内外组织标本库发展的现状及启示[J].中国实验诊断学，2010，14(1)：148-150.

[6]林晖，林长缨，刘医萌，等.科学管理传染病生物样本库确保生物安全[J].首都公共卫生，2010，(4)3：140-141.

[7]万美容，刘福民，刘小云.肿瘤组织库的建立与管理[J].徐州医学院学报，2009，29(2)：104-105.