中药蟾酥活性成分抗肿瘤作用研究进展*

姜伟奇

(上海中医药大学科技中心病毒与免疫实验室， 上海 201203)

蟾酥一词源于《本草衍义》属名贵中药，为蟾蜍科动物中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans Cantor)或黑眶蟾蜍(Bufo melanostictus Schneider)等的耳后腺及皮肤腺分泌的白色浆液，经加工干燥制成。主要产于中国河北、山东、江苏、浙江等地。本品性味甘辛、温、有毒，近年研究证明，蟾酥不仅可以镇痛、消炎、麻醉，还有抗癌、抗辐射、强心等多种生物活性[1，2]。由于蟾酥在临床治疗癌症方面具有确切药理活性，引起国内外学者广泛关注。本文将对蟾酥的化学成分和有关抗肿瘤作用加以综述，旨在为蟾酥的开发利用提供参考。

1 蟾酥的化学成分

蟾酥的化学成分比较复杂，现代药理研究发现蟾酥中主要含有多种强心甾体类化合物。通过对蟾酥的分离和鉴定，目前已确定其主要化学成分按结构分类如下[3-5]：(1)强心甾体类化合物，可分为：蟾毒配基类(bufogenins，BGs)、脂蟾毒配基(resibufogenin，RBG)、华蟾毒配基(cinobufagin，CBG)、远华蟾毒配基(telocinobufagin，TCBG)、蟾毒灵(bufalin，BL)、华蟾毒它灵(cinobufatalin)、日蟾毒它灵(gamabufotalinin)及南美蟾毒精等。(2)吲哚类生物碱及其衍生物，此类化合物含有吲哚环，是具有一定生物活性的水溶性吲哚生物碱，包含：蟾酥碱、蟾酥甲碱、5-羟色胺、去氢蟾酥碱等。(3)甾醇类，蟾酥含有胆甾醇、7α-羟基胆甾醇、7β-羟基胆甾醇、β-谷甾醇、麦角甾醇等。(4)其他类：近年来新发现的几种成分，有20，21-环氧蟾毒内酯、20S，21-环氧蟾毒配基、20R，21-环氧蟾毒配基、3-O-甲羧基-20S，21环氧蟾毒配基、3-O-20S，21-环氧蟾毒配基；蟾酥中尚含有肾上腺素及多种氨基酸。

目前研究表明，蟾酥及其活性成分具有抑制肿瘤细胞生长、诱导肿瘤细胞凋亡等作用。其中以有脂蟾毒配基、蟾毒灵和华蟾毒配基类化合物被认为是蟾酥抗肿瘤作用的主要活性成分。

2 蟾酥的抗肿瘤作用

近年来有研究报道，蟾酥及其制剂可抑制肿瘤细胞生长并能诱导肿瘤细胞凋亡，因而成为抗肿瘤药物研发的热点。蟾酥诱导细胞凋亡需要多种信号通路的调节，如线粒体途径、死亡受体途径、凋亡相关蛋白，如bcl-2，survivin，bax，p53基因和caspase蛋白等。其在蟾酥不同活性成分诱导的肿瘤细胞凋亡中发挥重要的作用。

2.1 蟾酥对白血病细胞的作用 Zhu等[6]研究表明蟾毒灵能以剂量时间依赖的方式抑制人急性早幼粒白血病NB4细胞增殖并诱导其发生凋亡，蟾毒灵协同MEK抑制剂PD98059作用于NB4细胞后能够下调survivin的表达，并促进caspase-3的活化。说明蟾毒灵诱导NB4细胞凋亡过程中与survivin 基因表达下调有关。在蟾毒灵诱导的人白血病细胞株HL-60凋亡过程中，Bcl-2表达水平降低的同时发生了Bcl-2的裂解。HL-60细胞中存在磷酸化的Bcl-2，在蟾毒灵诱导细胞凋亡的过程中，Bcl-2表达下调的同时磷酸化水平降低，即发生脱磷酸化。蟾毒灵短时间处理后，蛋白激酶C(PKC)总活性没有明显变化，但PKCβⅡ发生快速膜转位，随后出现了Bcl-2的脱磷酸化。表明蟾毒灵导人类白血病HL-60细胞凋亡的机制可能与Bcl-2表达下调、裂解及脱磷酸化有关，并且PKCβⅡ发生的膜转位活化可能参与了Bcl-2的脱磷酸化[7，8]。曲秀娟等[9]在研究SYK和Cbl家族蛋白在蟾毒灵诱导HL-60细胞凋亡过程中的作用机制发现蟾毒灵作用于HL-60细胞后，SYK蛋白快速被磷酸化，并以时间剂量依赖的方式下调Cbl和Cbl-b的表达，提示这可能也是蟾毒灵诱导细胞凋亡分子机制之一。刘云鹏等[10]在研究蟾毒灵诱导人白血病细胞株K562细胞分化和凋亡中发现，在细胞分化早期和细胞凋亡发生前，蟾毒灵明显下调K562细胞WT1 mRNA和蛋白的表达，提示蟾毒灵诱导K562细胞向单核巨噬细胞分化和细胞凋亡可能与其对WT1的下调有关。盛秀胜等[11]还发现华蟾素能浓度依赖的抑制K562细胞生长，并通过流式细胞术分析发现华蟾素诱导K562细胞凋亡，其机制与提高Caspase-3表达有关。

2.2 蟾酥对乳腺癌细胞的作用 Yan等[12]利用MTT法检测蟾毒灵对人腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231的细胞增殖活力，发现蟾毒灵对这2种细胞的增殖都有明显的抑制作用并且呈时间剂量依赖。运用western blot，反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)等技术测定细胞中DR4和DR5基因mRNA的含量，从而判定细胞中DR4和DR5基因的表达水平，又利用caspase活性检测和siRNA转染技术检测caspase-8的活化和PARP的裂解来进一步探讨蟾毒灵与TARIL诱导细胞凋亡协同效应的分子机制。实验证明了在MCF-7和MDA-MB-231细胞中蟾毒灵能增强TARIL通过激活外源性凋亡途径诱导的细胞凋亡并且蟾毒灵作用于细胞后与对照组相比DR4和DR5的表达显著上调。同时研究证明蟾毒灵能上调DR4和DR5的表达是通过激活ERK、JNK和P38MAPK途径并且下调Cbl-b实现的。Ma等[13]研究华蟾毒精诱导MDA-MB-231细胞凋亡的机制发现华蟾毒精能够以剂量时间依赖的方式抑制MDA-MB-231细胞的增殖，当用50μg/ml的华蟾毒精作用于细胞48 h后，早期细胞凋亡率与对照组相比有显著性差异，细胞周期阻滞在S期。利用原子力显微镜观察到华蟾毒精能破坏细胞骨架改变细胞表面超微结构和细胞形态。为进一步研究华蟾毒精诱导细胞凋亡的分子机制提供新的思路。

2.3 蟾酥对肺癌细胞的作用 肺癌是最常见的恶性肿瘤之一。非小细胞肺癌约占肺癌病例的80～85%，其中大部分患者被诊断时已经是晚期[14]。有研究证实[15～16]在体外实验条件下，采用不同浓度的蟾毒灵作用于A549细胞后，发现蟾毒灵能抑制细胞增殖，且呈剂量时间依赖。通过Western blot检测相关蛋白的表达，结果显示蟾毒灵可以抑制Akt的活化，蟾毒灵与Akt抑制剂联合作用于A549细胞后能诱导其凋亡，并能上调Bax的表达，下调Bcl-2和livin的表达，进一步活化caspase-3。提示蟾毒灵诱导A549细胞凋亡是通过抑制PI3K/Akt途径实现的。陈同生等[17]采用基因质粒转染技术、荧光发射谱检测分析以及荧光共振能量转移(FRET)受体光漂泊技术，首次在活细胞中实时检测蟾酥诱导人肺腺癌(ASTC-a-1)细胞凋亡过程中caspase-3的活化特性。采用CCK-8技术检测发现，蟾酥可以有效抑制ASTC-a-1细胞的增殖活性并具有剂量依赖性。用蟾酥处理稳定表达FRET质粒SCAT3的人肺腺癌ASTC-a-1细胞，采用荧光发射谱检测分析以及荧光共振能量转移受体光漂白技术，2h后明显观察到活化的caspase-3将SCAT3切割为两部分，并且SCAT3的切割程度随着蟾酥作用时间的延长而增加，24 h内细胞内的SCAT3完全被切割。表明caspase-3 参与调控了蟾酥诱导的细胞凋亡过程。Sun[18]等研究发现，当蟾毒灵作用于人肺腺癌ASTC-a-1 细胞时可以产生大量活性氧，同时增强caspase-3 活性，促使凋亡蛋白Bax 从细胞质向线粒体移位，从而诱导ASTC-a-1 细胞凋亡。

2.4 蟾酥对肝癌细胞的作用 Qi等[19]发现蟾毒灵和华蟾毒精能显著改变肝癌细胞株HepG2凋亡形态，使凋亡细胞数量显著增加。其诱导细胞凋亡的途径与上调Fas、Bax、Bid的表达，抑制Bcl-2蛋白表达，同时降低线粒体膜电位，释放细胞色素C，活化Caspase-3，8，9，10有关。提示蟾毒灵和华蟾毒精诱导细胞凋亡的机制主要是通过Fas和线粒体途径介导的。另有研究表明蟾毒灵作用于HepG2后可使细胞周期阻滞在G2/M期通过下调Aurora A、CDC25、CDK1、cyclin A并上调p53和p21蛋白的表达，同时降低线粒体膜电位使细胞内Ca水平和活性氧的产生增加，活化caspase-9和caspase-3[20]。

肖义秀等[21]通过流式细胞术检测发现脂蟾毒配基能诱导人肝癌细胞Bel-7402发生凋亡，其凋亡率超过50%，呈剂量依赖。脂蟾毒配基作用于Bel-7402后，Bax蛋白表达增加，对细胞凋亡的产生具有促进作用，并与Bcl-2蛋白表达的下降有协同作用。黄应申等[22]通过流式细胞术和Western Blot等实验方法研究发现脂蟾毒配基还可引起线粒体跨膜电位下降，细胞色素C释放增多，活化Caspase-3，同时抑制Bcl-2蛋白表达，诱导细胞凋亡。

2.5 蟾酥对胃癌细胞的作用 Li等[23]实验结果显示蟾毒灵能剂量和时间依赖性的抑制胃癌细胞株MGC803的增殖，在低浓度为20 nmol/l下蟾毒灵可诱导细胞周期阻滞在M期。在高浓度80 nmol/l下能诱导细胞凋亡。一方面可能与下调Bcl-2的表达，降低Bcl-2/Bax比值并活化caspase-3有关。另一方面，研究中还发现蟾毒灵能瞬时激活PI3K/Akt信号通路随后再将其完全抑制，上调Cbl的表达，这些结果表明PI3K/Ak通路可能在蟾毒灵诱导胃癌MGC803细胞凋亡过程中发挥关键作用。孟书聪等[24]利用流式细胞术检测细胞周期、细胞凋亡率及其线粒体膜电位变化；Western blot检测与细胞凋亡相关基因蛋白表达的变化。实验证明脂蟾毒配基能显著抑制细胞生长，且呈剂量时间依赖。低剂量作用时间为24～48 h，将细胞阻滞在S期，处于G2/M期的细胞数量少，随作用时间延长阻滞细胞在G2/M 期。脂蟾毒配基引起细胞线粒体膜电位下降，释放到胞质中的细胞色素C增多，促进caspase-3活化，抑制Bcl-2的表达，诱导细胞凋亡。进一步表明脂蟾毒配基可诱导人胃癌BGC-823细胞发生凋亡，其诱导凋亡作用机制与线粒体通路有关。

2.6 蟾酥对宫颈癌细胞 Cao等[25]研究发现当用10-8M的蟾毒灵作用于人宫颈癌Hela细胞时，细胞凋亡程度具有时间依赖性。而且细胞中Tiam1蛋白含量开始增加，在30 min后达到最大表达量，随着时间的延长Tiam1蛋白表达水平逐渐下降。提示Taim1蛋白在蟾毒灵诱导的Hela细胞凋亡中发挥重要作用。王鹂等[26]采用MTT法和流式细胞术等实验方法研究华蟾毒精抑制Hela细胞增殖作用机制，结果表明华蟾毒精对Hela细胞的增殖有显著的抑制作用。可使细胞周期阻滞在G2/M期，并对Hela细胞内相对分子质量较小的酸性蛋白表达有明显的影响。Emam等[27]研究结果显示，华蟾毒它灵作用于Hela细胞后，线粒体膜电位下降，细胞内钙离子和活性氧的产生增加。此外，华蟾毒它灵能上调Fas、Bid、Bax的表达并活化细胞色素C和caspase-2，-3，-8，-9，提示华蟾毒它灵诱导Hela细胞凋亡主要是通过Fas和线粒体途径介导的。

3 小结

蟾酥在中国的用药历史悠久，具有较强的药理活性，受到研究者的广泛关注。近年来的研究结果已经证实蟾酥及其活性成分对于白血病、乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌等肿瘤细胞具有有效的抗癌活性。但蟾酥作为药物使用可导致头晕、恶心、抽搐甚至死亡[28]。这些毒副作用加大了临床使用风险，不适合长期连续服用。因此，要加强临床前的实验研究，确定临床有效的用药剂量，提高临床用药的安全性和有效性。蟾酥成分复杂，目前的研究表明，蟾酥不同活性成分发挥抗肿瘤作用具有多靶点的特征。因此，需充分利用现代分子生物学技术全面深入的阐明蟾酥活性成分抗肿瘤的作用机制，为研制出高效低毒的抗癌药物提供理论依据。

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