金线莲的结实特性和无菌播种培养
2014-11-15何荆洲等
何荆洲等
摘要：观察金线莲的结实性情况，比较其蒴果采收期4种基本培养基、NAA与6-BA激素组合及水果添加物对金线莲无菌播种膨大率及萌发率的影响。结果表明：（1）不同杂交组合的结实率存在明显差异，结实率变化范围为0～100%；（2）蒴果在授粉后45 d采收最好，种子的膨大率、萌发率均较高；（3）不同基本培养基对金线莲种子的膨大萌发效果不同，种子在WPM培养基上的膨大萌发率最高，膨大率最高达73%，萌发率最高为79%；（4）不同生长激素组合对金线莲种子的膨大萌发影响差异显著，以1/2MS+0.5 mg/L NAA的效果最好；（5）不同水果有机添加物都对金线莲种子的膨大萌发有促进作用。
关键词：金线莲；蒴果；无菌播种；膨大率；萌发率
中图分类号： S567.23+9.04文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0214-04
收稿日期：2013-11-04
目前国内对金线莲的组织培养研究主要集中在原球茎培养[5-6]和丛生芽培养[7-8]方面，在种子培养方面，伍成厚等报道了金线莲种子培养过程中类原球茎的诱导及其分化[9]，罗安雄等则探讨了不同培养基对金线莲种子萌发以及幼苗生长的影响[10]。本研究对2个金线莲品种进行了自交及正反交，并观察了结实情况、蒴果采收时间和培养基成分等因素对金线莲非共生萌发的影响，以期建立金线莲无菌播种繁殖技术，为金线莲育种提供技术参考。
1材料与方法
1.1试验材料
2个金线莲品种材料均取自广西农业科学院花卉研究所观赏植物研发中心的育苗温室，其编号和品种的主要性状、形态分别见表1、图1。
1.2试验地概况
1.3试验方法
1.3.1授粉在亲本花中选取开放3～7 d内的花朵，用牙签取其蕊柱上呈浅黄色、具有黏性的花粉块，并置于亲本花的柱头蕊腔内。
1.3.2蒴果发育情况的测量以及结实率的统计蒴果采收后用分析天平称质量并用游标卡尺测量果荚最终长、宽；计算结实率（采收的蒴果占授粉花朵数的百分数）。
1.3.3种子预处理与播种将果荚置于流水下，用软毛刷小心刷洗表皮后用洗衣粉水浸泡10 min（期间不停晃动），再用流水冲洗30 min；在超净工作台上用75%乙醇擦拭表面后用无菌水冲洗1次，接着用1%氯化汞浸泡蒴果8 min，再用无菌水冲洗4次；吸干表面水分，用解剖刀纵向切开蒴果，将种子均匀播撒在培养基上；暗培养7 d后转入光照培养条件，光照时间为10 h/d，光照强度1 000～1 500 lx，培养温度保持在26～30 ℃。
1.4种子萌发试验
1.4.1蒴果成熟度对比试验采用单因素试验法，进行不同成熟度蒴果的对比试验，即授粉后31、45、52 d的种子在配方为1/2 MS+1 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+20 g/L蔗糖、pH值5.6的培养基中进行培养。
1.4.2基本培养基对比试验采用单因素比较法，进行种子诱导萌动的基本培养基对比试验，即MS（高盐）培养基、1/2MS（中盐）培养基、WPM（中盐、高钙、高钾）培养基及KC（低盐）培养基4个处理，并附加20 g/L蔗糖、6.5 g/L琼脂，调节pH值为5.6。
1.4.3生长激素组合的对比试验以295自交种子为材料，选用0、0.5、1.0、1.5 mg/L 6-BA与0、0.2、0.5 mg/L NAA两者的组合共8个处理，加上清水对照共9个处理，均附加20 g/L 蔗糖、6.5 g/L琼脂，最后调节pH值为5.6，具体见表2。
2结果与分析
2.1蒴果结实特性及基本特征
由表3、图2可知，无论是在形状还是颜色方面，2种金线莲的蒴果及种子都无明显差别；但自交结实率差异明显，295的自交结实率比较高，为92.77%，而294仅为63.75%，两者之间相差29.02百分点；294与295之间的正反交结实率分别为100.00%、0，表明在正交成功的情况下，反交可能不会杂交成功，因此金线莲在杂交育种时，同时进行正反交有助于提高成功率。
2.2种子萌发
2.2.1蒴果采收期对种子萌发的影响将授粉后分别发育了31、45、52 d的种子播种于1/2MS培养基中，分别培养10、16周，统计种子的膨大率、萌发率。由表4可见，授粉后31 d，294×294未见种子的膨大与萌发，295×295种子的膨大率仅为28.0%，萌发率为35.0%；授粉后45 d，2个品种的膨大率和萌发率都显著提高，其中295种子的膨大率达到99.0%，萌发率达到91.0%；授粉后52 d，种子的膨大率和萌发率都比45 d的种子有所下降，其中295×295种子的膨大率相差达36百分点，萌发率相差达18百分点；同一采收期的294×294种子，不论是膨大率还是萌发率都显著低于295×295（除授粉后31 d）
。结果表明，当蒴果采收期为45 d时，最有利于膨大形成原球茎（图3），且后续发育形成原球茎的速度也较快；而当蒴果采收期只有31 d时，不能或很难膨大形成原球茎；当蒴果采收期达52 d时，果荚饱满并有轻微皱缩，但尚未开裂，说明种子已经完全成熟，但其膨大率和萌发率反而有所下降。总体结果可以看出，不同金线莲品种之间的膨大、萌发效果相差较大。
2.2.2基本培养基对种子萌发的影响金线莲种子在4种基本培养基上膨大萌发的原球茎外形无明显差异。但在MS和KC培养基上的种子膨大时间比在1/2MS和WPM培养基上的晚，原球茎也没有那么粗壮。不论是在种子膨大成原球茎还是在原球茎分化成幼苗方面，WPM组都比较粗壮，优于其他3组。综合试验结果，在发育形态方面金线莲基本培养基的优劣顺序为：WPM>1/2MS>MS>KC。endprint
2.2.3生长激素组合对种子萌发的影响由表6可知，单独使用NAA对金线莲种子膨大萌发最为有利，高于NAA与6-BA不同浓度的组合配比；而单独添加6-BA的膨大率低于空白对照组，萌发率与空白对照组无显著性差异；随着6-BA浓度的升高，膨大率、萌发率出现一定的升高趋势，但差异不显著。推测可能是低浓度的6-BA对金线莲种子萌发有一定的抑制作用。
2.2.4水果添加物对种子萌发的影响由表7可见，与对照组相比，添加不同的水果有机物对金线莲种子膨大有一定的促进作用，且不同处理间存在显著差异。其膨大率大小为：香蕉汁>马铃薯汁>苹果汁>椰子汁；萌发率大小为：马铃薯汁、苹果汁>椰子汁>香蕉汁。可以看出，加入香蕉汁的培养基对种子膨大的促进效果比添加椰子汁、苹果汁和马铃薯汁的更显著，但添加香蕉汁的培养基在种子萌发成幼苗时的萌发率比其他3组显著下降，这说明香蕉有促进种子吸水膨大的良好效果，但同时在种子萌发成苗的过程中起一定的抑制作用。综合试验结果可知，添加马铃薯汁对金线莲种子的膨大、萌发最有利。
3结论
通过种子无菌播种，可缩短杂交育种周期，提高育种效率，加快种苗规模化生产进程，是金线莲种质资源保存利用的关键技术环节。目前国内在金线莲无菌播种技术应用研究方面做得比较少，且金线莲不同品种对基本培养基、激素组合配比和水果添加物的选择等有一定的差别。因此，本试验以2个金线莲品种的杂交蒴果为材料，探讨了蒴果采收时间、培养基成分、激素组合配比等因素对种子膨大萌发的影响，结果表明：（1）授粉后45 d的种子无菌播种后膨大率、萌发率都显著高于52 d的，这与张娟娟等研究的某些兰科植物的种子成熟前比成熟后在无菌萌发过程中具有较高的萌发率相一致[11]，推测可能是由于种皮开始皱缩，木质素类物质积累，种皮透水性下降导致萌发率下降，因此金线莲在野生环境下需要相应的共生真菌侵染后才能萌发；（2）4种培养基中MS无机盐含量最高，属于高盐培养基，1/2MS为中盐培养基，WPM也是中盐培养基，但相对而言钙、钾含量高，这说明低磷浓度有利于金线莲种子的萌发，而高浓度的无机盐含量不利于其膨大萌发，KC属于低盐培养基，且营养成分比较简单，可能不足以支持种子的萌发，同时说明金线莲种子萌发需要有充足的营养；（3）本试验中单独使用NAA对金线莲种子萌发最为有利，显著高于NAA与6-BA不同浓度组合配比，推测可能是细胞分裂素信号的转导是通过磷酸基团在主要组分之间连续传递而实现的[12]，而低磷浓度有利于金线莲种子的萌发，因此6-BA对金线莲种子萌发起不到促进作用，NAA与6-BA同时配合使用时，6-BA通过促进细胞的分化，在一定程度上对抗着NAA的作用，因此NAA与6-BA不同浓度组合与空白对照组无明显差异，也可能是激素浓度范围过小或激素种类过少造成的结果，在以后的试验中可以适当扩大激素范围浓度和种类；（4）天然水果添加物的成分比较复杂，大多含有氨基酸、激素、酶等一些复杂的化合物，它们对细胞和组织的增殖、分化有明显的促进作用，培养基中添加香蕉汁，可有效促进金线莲种子的膨大，却又抑制了其萌发，这可能是成熟的香蕉中含有较多的植物生长激素，有利于膨大，同时又含有较高的可溶性糖，提高了培养基的碳/氮比，从而抑制了种子的萌发；（5）金线莲品种之间的膨大萌发效果相差显著。
种子萌发是一个复杂的植物生理过程，在自然环境中，金线莲种子只有经过适宜的真菌侵染才能萌发，且萌发率低，因而其野生资源十分匮乏。金线莲每个果荚中都含有成千上万粒种子，通过无菌播种手段可以使之萌发成苗，应用于生产上可以加速金线莲的繁殖，为中药材和花卉市场提供大量的商品苗，具有良好的应用前景。此外，通过无菌播种手段也可以促进金线莲资源的再生，对野生资源的保护也会起到积极的作用。
参考文献：
[1]钟岑生. 金线莲的药用价值与开发[J]. 广西农业科学，1997（2）：51-53.
[2]李介元. 台湾金线莲[J]. 台湾农业探索，2001（2）：42.
[3]陈裕，林坤瑞，管其宽，等. 金线莲生物学特性及生境特点的研究[J]. 亚热带植物通讯，1994，23（1）：18-24.
[4]蔡文燕，肖华山，范秀珍.金线莲研究进展（综述）[J]. 亚热带植物科学，2003，32（3）：68-72.
[5]王建勤，林兰英，陈钢. 金线莲原球茎的诱导与植株再生[J]. 植物学通报，1996，13（1）：55-56.
[6]韩晓红，罗明英，欧阳志成，等. 金线莲原球茎增殖研究[J]. 北方园艺，2012（24）：144-146.
[7]孟志霞，郭顺星，于雪梅，等. 植物生长调节剂对福建金线莲丛生芽增殖的影响[J]. 中国药学杂志，2008，43（23）：1777-1780.
[8]阚世超，张明生，李花. 金线莲丛生芽诱导研究[J]. 安徽农业科学，2009，37（3）：981-982.
[9]伍成厚，冯毅敏，贺漫媚，等. 金线莲种子培养的研究[J]. 中国野生植物资源，2008，27（1）：47-50.
[10]罗安雄，孟志霞，陈晓梅，等. 福建金线莲种子萌发及幼苗培养研究[J]. 中国药学杂志，2012，47（15）：1199-1203.
[11]张娟娟，严宁，胡虹. 三种兜兰属植物种子发育过程及其与无菌萌发的关系[J]. 植物分类与资源学报，2013，35（1）：33-40.
[12]许智宏，薛红卫. 植物激素作用的分子机理[M]. 上海：上海科学技术出版社，2012.马凤霞，赵权. 乙烯利、ABA对北五味子品质的影响[J]. 江苏农业科学，2014，42（9）：218-220.endprint
2.2.3生长激素组合对种子萌发的影响由表6可知，单独使用NAA对金线莲种子膨大萌发最为有利，高于NAA与6-BA不同浓度的组合配比；而单独添加6-BA的膨大率低于空白对照组，萌发率与空白对照组无显著性差异；随着6-BA浓度的升高，膨大率、萌发率出现一定的升高趋势，但差异不显著。推测可能是低浓度的6-BA对金线莲种子萌发有一定的抑制作用。
2.2.4水果添加物对种子萌发的影响由表7可见，与对照组相比，添加不同的水果有机物对金线莲种子膨大有一定的促进作用，且不同处理间存在显著差异。其膨大率大小为：香蕉汁>马铃薯汁>苹果汁>椰子汁；萌发率大小为：马铃薯汁、苹果汁>椰子汁>香蕉汁。可以看出，加入香蕉汁的培养基对种子膨大的促进效果比添加椰子汁、苹果汁和马铃薯汁的更显著，但添加香蕉汁的培养基在种子萌发成幼苗时的萌发率比其他3组显著下降，这说明香蕉有促进种子吸水膨大的良好效果，但同时在种子萌发成苗的过程中起一定的抑制作用。综合试验结果可知，添加马铃薯汁对金线莲种子的膨大、萌发最有利。
3结论
通过种子无菌播种，可缩短杂交育种周期，提高育种效率，加快种苗规模化生产进程，是金线莲种质资源保存利用的关键技术环节。目前国内在金线莲无菌播种技术应用研究方面做得比较少，且金线莲不同品种对基本培养基、激素组合配比和水果添加物的选择等有一定的差别。因此，本试验以2个金线莲品种的杂交蒴果为材料，探讨了蒴果采收时间、培养基成分、激素组合配比等因素对种子膨大萌发的影响，结果表明：（1）授粉后45 d的种子无菌播种后膨大率、萌发率都显著高于52 d的，这与张娟娟等研究的某些兰科植物的种子成熟前比成熟后在无菌萌发过程中具有较高的萌发率相一致[11]，推测可能是由于种皮开始皱缩，木质素类物质积累，种皮透水性下降导致萌发率下降，因此金线莲在野生环境下需要相应的共生真菌侵染后才能萌发；（2）4种培养基中MS无机盐含量最高，属于高盐培养基，1/2MS为中盐培养基，WPM也是中盐培养基，但相对而言钙、钾含量高，这说明低磷浓度有利于金线莲种子的萌发，而高浓度的无机盐含量不利于其膨大萌发，KC属于低盐培养基，且营养成分比较简单，可能不足以支持种子的萌发，同时说明金线莲种子萌发需要有充足的营养；（3）本试验中单独使用NAA对金线莲种子萌发最为有利，显著高于NAA与6-BA不同浓度组合配比，推测可能是细胞分裂素信号的转导是通过磷酸基团在主要组分之间连续传递而实现的[12]，而低磷浓度有利于金线莲种子的萌发，因此6-BA对金线莲种子萌发起不到促进作用，NAA与6-BA同时配合使用时，6-BA通过促进细胞的分化，在一定程度上对抗着NAA的作用，因此NAA与6-BA不同浓度组合与空白对照组无明显差异，也可能是激素浓度范围过小或激素种类过少造成的结果，在以后的试验中可以适当扩大激素范围浓度和种类；（4）天然水果添加物的成分比较复杂，大多含有氨基酸、激素、酶等一些复杂的化合物，它们对细胞和组织的增殖、分化有明显的促进作用，培养基中添加香蕉汁，可有效促进金线莲种子的膨大，却又抑制了其萌发，这可能是成熟的香蕉中含有较多的植物生长激素，有利于膨大，同时又含有较高的可溶性糖，提高了培养基的碳/氮比，从而抑制了种子的萌发；（5）金线莲品种之间的膨大萌发效果相差显著。
种子萌发是一个复杂的植物生理过程，在自然环境中，金线莲种子只有经过适宜的真菌侵染才能萌发，且萌发率低，因而其野生资源十分匮乏。金线莲每个果荚中都含有成千上万粒种子，通过无菌播种手段可以使之萌发成苗，应用于生产上可以加速金线莲的繁殖，为中药材和花卉市场提供大量的商品苗，具有良好的应用前景。此外，通过无菌播种手段也可以促进金线莲资源的再生，对野生资源的保护也会起到积极的作用。
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2.2.3生长激素组合对种子萌发的影响由表6可知，单独使用NAA对金线莲种子膨大萌发最为有利，高于NAA与6-BA不同浓度的组合配比；而单独添加6-BA的膨大率低于空白对照组，萌发率与空白对照组无显著性差异；随着6-BA浓度的升高，膨大率、萌发率出现一定的升高趋势，但差异不显著。推测可能是低浓度的6-BA对金线莲种子萌发有一定的抑制作用。
2.2.4水果添加物对种子萌发的影响由表7可见，与对照组相比，添加不同的水果有机物对金线莲种子膨大有一定的促进作用，且不同处理间存在显著差异。其膨大率大小为：香蕉汁>马铃薯汁>苹果汁>椰子汁；萌发率大小为：马铃薯汁、苹果汁>椰子汁>香蕉汁。可以看出，加入香蕉汁的培养基对种子膨大的促进效果比添加椰子汁、苹果汁和马铃薯汁的更显著，但添加香蕉汁的培养基在种子萌发成幼苗时的萌发率比其他3组显著下降，这说明香蕉有促进种子吸水膨大的良好效果，但同时在种子萌发成苗的过程中起一定的抑制作用。综合试验结果可知，添加马铃薯汁对金线莲种子的膨大、萌发最有利。
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通过种子无菌播种，可缩短杂交育种周期，提高育种效率，加快种苗规模化生产进程，是金线莲种质资源保存利用的关键技术环节。目前国内在金线莲无菌播种技术应用研究方面做得比较少，且金线莲不同品种对基本培养基、激素组合配比和水果添加物的选择等有一定的差别。因此，本试验以2个金线莲品种的杂交蒴果为材料，探讨了蒴果采收时间、培养基成分、激素组合配比等因素对种子膨大萌发的影响，结果表明：（1）授粉后45 d的种子无菌播种后膨大率、萌发率都显著高于52 d的，这与张娟娟等研究的某些兰科植物的种子成熟前比成熟后在无菌萌发过程中具有较高的萌发率相一致[11]，推测可能是由于种皮开始皱缩，木质素类物质积累，种皮透水性下降导致萌发率下降，因此金线莲在野生环境下需要相应的共生真菌侵染后才能萌发；（2）4种培养基中MS无机盐含量最高，属于高盐培养基，1/2MS为中盐培养基，WPM也是中盐培养基，但相对而言钙、钾含量高，这说明低磷浓度有利于金线莲种子的萌发，而高浓度的无机盐含量不利于其膨大萌发，KC属于低盐培养基，且营养成分比较简单，可能不足以支持种子的萌发，同时说明金线莲种子萌发需要有充足的营养；（3）本试验中单独使用NAA对金线莲种子萌发最为有利，显著高于NAA与6-BA不同浓度组合配比，推测可能是细胞分裂素信号的转导是通过磷酸基团在主要组分之间连续传递而实现的[12]，而低磷浓度有利于金线莲种子的萌发，因此6-BA对金线莲种子萌发起不到促进作用，NAA与6-BA同时配合使用时，6-BA通过促进细胞的分化，在一定程度上对抗着NAA的作用，因此NAA与6-BA不同浓度组合与空白对照组无明显差异，也可能是激素浓度范围过小或激素种类过少造成的结果，在以后的试验中可以适当扩大激素范围浓度和种类；（4）天然水果添加物的成分比较复杂，大多含有氨基酸、激素、酶等一些复杂的化合物，它们对细胞和组织的增殖、分化有明显的促进作用，培养基中添加香蕉汁，可有效促进金线莲种子的膨大，却又抑制了其萌发，这可能是成熟的香蕉中含有较多的植物生长激素，有利于膨大，同时又含有较高的可溶性糖，提高了培养基的碳/氮比，从而抑制了种子的萌发；（5）金线莲品种之间的膨大萌发效果相差显著。
种子萌发是一个复杂的植物生理过程，在自然环境中，金线莲种子只有经过适宜的真菌侵染才能萌发，且萌发率低，因而其野生资源十分匮乏。金线莲每个果荚中都含有成千上万粒种子，通过无菌播种手段可以使之萌发成苗，应用于生产上可以加速金线莲的繁殖，为中药材和花卉市场提供大量的商品苗，具有良好的应用前景。此外，通过无菌播种手段也可以促进金线莲资源的再生，对野生资源的保护也会起到积极的作用。
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