抗盐玫瑰组培快繁体系的建立

2014-11-15李雪马媛春程宗明

江苏农业科学 2014年9期

李雪　马媛春　程宗明

摘要：以抗盐玫瑰当年生去叶的幼嫩单芽茎段为试验材料，建立体外无性快繁体系。结果表明，适宜玫瑰离体腋芽发芽的最佳培养基配方为MS+0.5 mg/L 6-BA和MS+1.5 mg/L 6-BA；适宜丛生芽继代增殖的最佳培养基配方为MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA和3/4MS+0.3 mg/L IBA；适宜组培苗生根的最佳培养基配方为1/2MS+03 mg/L NAA，其生根率可达95%。生根苗木移栽成活率可达87%以上。该体系可以用于抗盐玫瑰的快速大量繁殖。

关键词：抗盐玫瑰；组培快繁体系；培养基；萌发；继代培养；生根诱导；移栽驯化

中图分类号： S685.120.4+3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0050-04

收稿日期：2014-04-05

基金项目：江苏省农业科技自主创新资金[编号：CX（14）2051]。

作者简介：李雪（1987—），女，山东德州人，硕士研究生，主要从事园艺植物生物技术研究。E-mail：smilexueok@163.com。

通信作者：程宗明，博士，教授，主要从事果实系统生物学研究。E-mail：zmc@njau.edu.cn。玫瑰（Rosa rugosa L.）是蔷薇科蔷薇属植物，广泛分布在东亚、欧洲和北美洲地区。它花型秀美，色彩艳丽，气味芳香，形色俱佳。玫瑰花朵主要用于提炼香精玫瑰油，玫瑰油比等重量黄金价值还高，主要应用于化妆品、食品、精细化工等。玫瑰花瓣还可直接被腌制成食品，作调味剂使用，同时它的干燥花蕾也是一种重要的传统中药材[1]。经测定，玫瑰的果实中含有大量的维生素A、维生素B、维生素C，还含有10多种氨基酸、可溶性糖、生物碱和无机元素等[2-4]。常食玫瑰果可以预防冠心病、肝病、急慢性传染病和阻止产生致癌物质等。玫瑰果实还常常被用来制作成浓缩维生素制剂。此外，玫瑰还具有较强的抗逆性[5]。玫瑰种子发芽慢，扦插繁殖困难，采用组织培养的方法繁殖玫瑰，不但生产周期短，繁殖系数高，而且成本低，经济效益很高。江苏省东部沿海滩涂盐碱浓度高，极少园林和观赏植物能够在此生长。近几年来，笔者试种的一些抗盐玫瑰单株具有较强耐盐能力，利用这些耐盐单株建立玫瑰离体快繁体系，是实现良种快繁以及产业化发展的客观需求。

1材料与方法

1.1试验材料

该供试材料为当年生实生苗，种子来自美国海滨，经过3个月沙藏保存后于翌年3月初播种，其盛花期见图1。

1.2方法

1.2.1外植体的消毒处理3月中旬从优良健壮植株剪取当年生枝条中段带芽的幼嫩茎段，用毛刷蘸取洗衣粉水轻轻刷洗后，剪成5.0 cm左右茎条，再流水冲洗2 h左右。在超净工作台上，先将茎段用70%乙醇溶液消毒30 s，用无菌水冲洗2～3次，然后置于0.1%HgCl2溶液中消毒3～5 min，再用无菌水冲洗3～5次。用无菌滤纸吸干材料表面的水分，最后将幼嫩茎条剪切成1.0 cm左右的带芽茎段，接种[6]。

1.2.2腋芽的萌发诱导将已处理的无菌茎段接种于腋芽诱导培养基上进行诱导培养。基本诱导培养基为MS培养基，对基本培养基添加不同浓度的细胞分裂素6-BA（6-benzylaminopurine，6-苄氨基腺嘌呤）、大量元素和有机元素，共组成5种配方的培养基：MS+0.5 mg/L 6-BA、MS+1.5 mg/L 6-BA、MS+2.5 mg/L 6-BA、3/2MS+2.5 mg/L 6-BA、MS+2.5 mg/L 6-BA（有机元素为1.5倍）。每种培养基上均接种30个离体茎段，每个处理重复3次，首先暗培养处理5 d，以减轻外植体的褐化现象[7-9]，培养4周后统计腋芽萌发率。

1.2.3继代增殖培养将诱导培养基上已经萌发的嫩芽剪切下来转接到继代培养基上生长，共设8种继代培养基：MS+ 0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA、MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA、MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA、MS+0.5 mg/L 6-BA+01 mg/L NAA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA、MS+0.3 mg/L IBA、3/4MS+0.3 mg/L IBA。每种培养基均接种20个0.5～1.0 cm长的单芽茎段，每个处理重复3次，培养30 d后，统计茎高≥2.0 cm的苗的数量。

1.2.4生根培养从继代培养苗中选取生长健壮的幼苗，转接到生根培养基上，共组成5种生根培养基：1/2MS+0.1 mg/L NAA、1/2MS+0.3 mg/L NAA、1/2MS+0.5 mg/L NAA、1/2MS+0.3 mg/L IBA、1/2MS+0.4 mg/L IBA。每种培养基均接种20个幼苗，每个处理重复3次，接种20 d后统计幼苗的生根情况。

1.2.5组培苗的驯化移栽

1.2.5.1组培苗的驯化将长势良好、株高5.0 cm以上的生根组培苗的瓶盖拧松，放置5 d后开始每天倒入约3 mm厚的无菌水并逐渐开盖，7 d后时彻底揭开瓶盖，在持续该环境下观察3 d。拧松瓶盖后须每天添加无菌水，这样不但能够防止培养基被彻底风干，还能为组培苗补充适当的水分。

1.2.5.2组培苗的移栽将长势依旧健壮且无污染的幼苗用镊子从组培瓶中小心取出，再用无菌水轻轻将附着的培养基洗掉，注意不要伤根。同时剪掉幼苗基部叶片，仅保留顶端3～5张复叶，再移栽到光照培养箱中。移栽所用的基质先121 ℃、30 min高压蒸汽灭菌，基质中蛭石 ∶草炭土 ∶珍珠岩为9 ∶3 ∶1.5，移栽完毕后浇透水，并用0.1%多菌灵溶液喷雾保苗。培养箱温度设置为22 ℃，昼夜温差2～3 ℃，相对湿度为90%，光照强度为100 μmol/（m2·s），光照时间为12 h/d，其间喷水2～3次/d，同时注意防治病菌。移栽5 d后可以增加光照强度并且适当降低浇水量[10]。

1.2.6统计分析数据分析采用Excel和SPSS软件进行。

2结果与分析

2.1离体芽的诱导

之前预试验中采芽时间分别为3月中旬、5月中旬、7月中旬、9月中旬、10月中旬，结果以3月采芽试验效果最好，因此正式试验都采用3月的取样。玫瑰离体茎段接种2周后离体芽几乎全部萌发，但芽萌动后的生长状况却因培养基内生长调节剂浓度的不同而表现出差异。由表1可以看出，MS+2.5 mg/L 6-BA培养基上丛生芽少，节间极短，芽苗矮小；3/2MS+2.5 mg/L 6-BA培养基上分化率达157%，但节间极短；培养基MS+2.5 mg/L 6-BA（有机元素为1.5倍）上，丛生芽最少，节间短，芽苗矮小。以上3种培养基上芽苗均长势矮壮，说明细胞分裂素6-BA浓度过高反而会抑制生长[11]，增加大量元素含量和有机元素含量也并不利于玫瑰腋芽萌发。培养基MS+1.5 mg/L 6-BA和MS+0.5 mg/L 6-BA上分化率都高达170%，与其他处理差异显著，丛生芽多且生长健壮，虽然6-BA浓度为0.5 mg/L时茎秆稍细，但是并不影响其继代生长。重复试验筛选出适宜离体芽诱导分化的培养基配方为MS+0.5 mg/L 6-BA（图2）和MS+1.5 mg/L 6-BA（图3）。

2.2丛生芽的继代培养

继代增殖培养基采用的生长素为NAA（1-nnaphthaleneacetic acid，萘乙酸）和IBA（3-indolebutyricacid，3-吲哚丁酸）。玫瑰在8种继代增殖培养基上培养4周后，芽的增殖倍数和生长情况存在差异。由表2可以看出，玫瑰在培养基MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA和培养基MS+0.5 mg/L 6-BA +0.3 mg/L NAA上分别于3、5 d后开始出现叶片萎蔫现象，不久后死亡，说明生长素NAA和6-BA的组合并不适合这种玫瑰的继代增殖培养。玫瑰在培养基MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA上增殖倍数高达3.6，与其他处理差异显著，丛生芽多且生长健壮；MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA培养基上丛生芽少且有畸形苗；MS+0.5 mg/L 6-BA +0.3 mg/L IBA培养基上丛生芽少，叶粗厚变脆；MS+1.5 mg/L 6-BA +0.1 mg/L IBA 培养基上丛生芽最少，节间极短，苗丛密集，微型化。说明细胞分裂素和生长素的用量及配比对玫瑰的继代增殖都有重要影响。MS+0.3 mg/L IBA培养基上丛生芽较少，速度慢，个别苗生长细弱，而3/4MS+0.3 mg/L IBA培养基上增殖倍数高达3.8，与其他处理差异显著，丛生芽多且生长健壮，说明调节大量元素含量可有效提高繁殖系数。重复试验筛选出适宜玫瑰继代增殖的培养基配方为MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA（图4）和3/4MS+0.3 mg/L IBA（图5）。

2.3组培苗的生根培养

由表3可以明显看出，生长素NAA较IBA对抗盐玫瑰的组培诱导生根诱导效果更好。培养基1/2MS+0.1 mg/L NAA和1/2MS+0.3 mg/L IBA上组培苗生根率均为50%，平均根数分别为4条和5条，并且根系粗短；1/2MS+0.4 mg/L IBA培养基上组培苗生根率达75%，平均根数约为3.33条，虽然这种培养基比IBA浓度为0.3 mg/L时根系稍长，但由于根系细弱也不适于移栽（图6）；在培养基1/2MS + 0.3 mg/L NAA和培养基1/2MS+0.5 mg/L NAA上，组培苗生根率均高达95%，与其他处理差异显著，但是随着NAA浓度升高，

平均生根数反而减少，因此NAA浓度为0.5 mg/L时并不适合诱导生根。

在中间繁殖体增殖到一定数量即开始进行生根培养，由于嫩茎中细胞分裂素的累积，在转入生根培养基后增殖的趋势往往仍然很强，几乎没有不定根的发生。因此，生根培养要降低细胞分裂素浓度，增加生长素浓度[12-13]。重复试验筛选出诱导玫瑰组培苗生根的最佳培养基配方为1/2MS+0.3 mg/L NAA（图7），且根系良好，适于移栽。

2.4组培苗的驯化移栽

玫瑰组培苗驯化移栽15 d后，就可以过渡到正常温室或自然条件下生长（图8）。经重复试验发现，只要按照上述程

3结论与讨论

在抗盐玫瑰的腋芽诱导时期，以MS+0.5 mg/L 6-BA和MS+1.5 mg/L 6-BA这2种培养基配方的效果最佳；在继代与增殖时期，以MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA和3/4MS+0.3 mg/L IBA这2种培养基的效果最佳；在组培苗的诱导生根时期，以1/2MS+0.3 mg/L NAA培养基的效果最佳。

在玫瑰的继代增殖培养阶段发现，不同生长调节剂的配比是影响丛生芽继代增殖的关键。生长素IBA与6-BA结合比NAA与6-BA结合更加适合这种玫瑰的继代增殖培养。然而在玫瑰的生根培养中，生长素NAA却比IBA更利于促进玫瑰的生根，应用生长素IBA诱导的根普遍细弱。因此不同的生长阶段对生长调节剂的需求不同。

采用组织培养的方法繁殖玫瑰，生产周期短，整个周期仅4个月，且繁殖系数高，成本低，应有很高的经济效益和社会效益。另外，组培快繁技术可以保证种苗生长一致，并且能够克服种子繁殖苗木所带来的观赏性状不一致的缺点，提高苗木的商品规格，有利于进行玫瑰的工厂化生产，为良种快繁以及产业化发展奠定基础。本试验建立了抗盐玫瑰从初代、继代到生根离体快繁的完整体系，将为工厂化生产提供依据，且该试验大量扩繁选育的抗盐玫瑰单株，也将于江苏省东部沿海进行区域试验。

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