行气调神针刺疗法对缺血性卒中后抑郁大鼠左前皮质及海马CREB和PDE4mRNA表达的影响

崔倩倩，蔡圣朝，曹云燕，费爱华，朱才丰，徐 雯

（1.安徽中医药大学研究生部，安徽 合肥 230038；2.安徽中医药大学附属针灸医院，安徽 合肥 230061）

卒中后抑郁（post stroke depression，PSD）是一种常见的脑血管病并发症，表现为多种精神和躯体症状的复杂的情感精神障碍性疾病，既不同于一般抑郁症，又不同于一般抑郁心情，通常被定义为“卒中后抑郁状态”，临床以情绪控制能力差和（或）肢体活动障碍为主要表现。脑卒中患者的抑郁状态发生率较高，其患病率为30%～35%［1］。目前多数学者认为PSD与神经递质分泌异常有关，是病灶破坏了去甲肾上腺素能（noradrenergic，NE）和5－羟色胺（5－hydroxytryptamine，5－HT））神经细胞及其通路，使这两种递质低下而致抑郁［2］。临床上目前多使用抗抑郁药来控制PSD，但抗抑郁药物有较多的不良反应。亦有相关的中药可治疗PSD［3－4］，但长期服用亦可致肝肾损害。针刺作为一种“绿色疗法”正日益受到重视，大量临床对照试验证实针灸治疗PSD有一定的疗效［5］。前期临床研究表明，针刺人中、双侧合谷、双侧太冲可治疗PSD［6］。针刺治疗PSD的基础研究还不够深入，其改善作用与cAMP反应元件结合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）mRNA 和磷酸二酯酶4（phosphodiesterase 4，PDE4）mRNA表达调节的关系有待于进一步研究。

CREB是一种选择性结合cAMP反应元件的核蛋白，调控多种基因的表达。研究［7－8］表明CREB的磷酸化有利于治疗相关血管疾病和具有保护神经细胞的功能。另外，CREB具有调节多种复杂记忆方式的生物学功能，是长期记忆形成过程中重要的调制器［9］。特别是CREB可以参与阿片类物质依赖的形成［10］。

PDE具有水解细胞内第二信使（cAMP和cGMP）的功能，从而终结其所传导的生化作用。PDE4是PDE家族的成员之一，主要在神经细胞和炎性细胞内，与中枢神经系统和免疫系统的功能有密切的关 系［11］。 研 究［12－13］表 明 PDE4 的 抑 制 剂 可治疗老化相关疾病和中枢神经系统的损伤。

本研究拟通过观察行气调神针刺疗法（针刺人中，双侧合谷、双侧太冲）对PSD模型大鼠左前皮质及海马CREB和PDE4mRNA表达的干预作用，初步阐明PSD的发病机制及行气调神针刺疗法的作用机制，为其治疗PSD提供实验依据。

1 材料

1.1 动物 健康雄性SD大鼠80只，8月龄，体质量（300±50）g，购于南京医科大学实验动物中心，生产许可证号：SCXK（苏）2008－0004。适应性喂养1周后行旷野实验行为评分，将水平运动和垂直运动总分低于30分或高于120分的动物予以剔除。

1.2 药品及试剂 Trizol试剂：Invitrogen公司；逆转录试剂盒和PCR试剂：美国Thermo公司；琼脂糖凝胶：上海基因公司；DNA Marker：宝生物工程（大连）有限公司；溴化乙锭：美国Sigma公司；盐酸氟西汀胶囊：礼来苏州制药有限公司，国药准字J20080016。

1.3 主要仪器 PCR仪（S1000）、凝胶成像系统（GelDoc）和水平凝胶电泳系统：Bio－Rad公司；冷冻离心机（5417R）：德国Eppendorf公司；紫外观察灯：美国SIM公司；TPM－900型 Morris水迷宫：北京友诚嘉业生物科技有限公司；HZQ－C空气振荡仪：黑龙江省哈尔滨市东明医疗仪器厂；HPX－9052 MBE型数显电热恒温箱：上海博讯实业有限公司医疗器械厂。

2 方法

2.1 动物分组 80只大鼠按随机数字法分组，20只作为正常组，其余60只用于复制脑缺血模型。1周后行Zea Longa神经行为学评分以判断脑缺血模型是否复制成功，结果51只大鼠模型复制成功，7只大鼠死亡，2只大鼠模型复制不成功。随机将模型复制成功的动物分为模型组、针刺组（行气调神针刺疗法）、西药组（盐酸氟西汀治疗），每组17只，在PSD模型复制及治疗期间均有大鼠死亡，最后每组用于检测的大鼠均为11只。实验过程严格遵循2006年国家科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》的相关规定。

2.2 PSD模型复制 通过电凝大鼠大脑中动脉引起局部脑缺血［14］结合改良 Willner P等［15］方法（慢性应激＋孤养法）复制PSD模型。①脑缺血模型复制。10%水合氯醛（4ml／kg）腹腔麻醉，在颞骨前下紧邻颧弓前份上缘部位开窗，暴露0.5cm×0.5cm的骨窗。凝闭位于嗅束至大脑下静脉之间的大脑中动脉主干及周围小动脉分支。②慢性应激＋孤养法。大鼠在3周内安排7种应激方法，每天随机选取一种应激方法。正常组除第1天、第8天、第15天禁水，次日进行蔗糖水试验外，均正常进食、饮水。模型组、针刺组、西药组单笼饲养，开始21d的慢性应激，包括3次24h禁水，3次24h禁食，3次通宵照明，3次4℃冰水游泳5min，3次45℃恒温箱热烘5min，3次夹尾1min，3次30min高速水平振荡（160次／min），每种应激方法每周1次，随机选取。应激结束后继予以单笼饲养16d。

2.3 PSD模型检测 通过蔗糖水消耗量（测试动物对奖赏的欣快反应）、敞箱测定（垂直活动反映大鼠的兴趣高低，水平活动反映大鼠的运动活动性水平）和水迷宫测定（定位航行试验反映大鼠的学习能力情况，空间探索试验反映大鼠的空间记忆能力），在慢性应激的第1天和治疗的第21天，以及治疗6周结束后进行神经行为学评分。评分标准参考Zea Longa等［15］制定的6级评分法：无功能障碍为0分；不能伸展前肢为1分；向一侧旋转为2分；向一侧倾倒为3分；无自主活动伴意识抑制为4分；死亡为5分。评分为1～4分即模型复制成功。

2.4 治疗方法

2.4.1 针刺组：慢性应激的第8天开始，针刺SD大鼠的“人中”、双侧“合谷”、双侧“太冲”，取穴标准参照《实验针灸学》［16］，大鼠针刺后置于鼠架上留针15min，期间以捻转手法行针1次，每日1次，14d为1个疗程，疗程间隔1d，共3个疗程。

2.4.2 西药组：慢性应激的第8天开始，予0.231 g／ml氟西汀混悬液10ml／kg（即2.31mg／kg，相当于成人临床用量的7倍）灌胃治疗，每日1次，疗程与针刺组相同。

2.4.3 模型组和正常组：应激第8天开始，予以生理盐水10ml／kg灌胃，每日1次。

2.5 指标检测方法 治疗结束后，将大鼠断头取脑，置于冰面上分离左前皮质及左侧海马，放于－70℃冰箱备用。RT－PCR实验：根据文献确定β－actin、CREB及PDE4mRNA的PCR引物序列（见表1），引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。用Trizol一步法提取各组大鼠左前皮质与海马总mRNA，紫外分光光度计定量mRNA纯度较好。反应总体积20μl，含PCR混合物10μl，RT样品2μl，无RNA酶水6.4μl，上游引物、下游引物各0.8μl。逆转录42℃，60min，70℃，5min；开始 PCR 循环：变性94℃，30s，退火52℃，30s，延伸72℃，45s，共35个循环，最后1个循环于72℃继续反应10min。取5μl PCR产物上样于2%琼脂糖凝胶中进行电泳，20min后采用凝胶成像系统观察结果并进行拍照。

表1 β－actin、CREB及PDE4mRNA引物序列

2.6 统计学方法 采用SPSS 17.0进行统计学分析。连续型变量采用“均数±标准差（±s）”进行统计学描述。各组间均数比较，采用单因素方差分析。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

与正常组比较，模型组大鼠皮质及海马部位的CREB mRNA表达水平显著下调（P＜0.01），PDE4 mRNA表达水平显著上调（P＜0.01）；与模型组比较，西药及针刺组大鼠左前皮质及海马CREB mRNA表达水平明显上调（P＜0.01），PDE4mRNA表达水平明显下调（P＜0.01）。见表2、图1。

表2 各组大鼠左前皮质及海马CREB和PDE4mRNA表达水平比较（±s）

表2 各组大鼠左前皮质及海马CREB和PDE4mRNA表达水平比较（±s）

注：与正常组比较，＊＊P＜0.01；与模型组比较，＃＃P＜0.01；与西药组比较，△△P＜0.01。

正常 11 1.040±0.019 0.697±0.012 0.263±0.010 0.382±0.012模型 11 0.587±0.022＊＊ 0.498±0.014＊＊ 0.774±0.026＊＊ 0.682±0.024＊＊西药 11 0.852±0.012＃＃ 0.743±0.014＃＃ 0.371±0.013＃＃ 0.412±0.012＃＃针刺11 0.865±0.024＃＃0.726±0.014＃＃△△0.275±0.013＃＃△△0.416±0.016＃＃

图1 各组大鼠CREB、PDE4表达水平比较（RT－PCR法）

4 讨论

PSD属于中医学中风后“郁证”范畴。中医学对此早已有较多的认识，例如《黄帝内经》中就有较多关于情志致郁的论述，至明代《医学正传》首先采用“郁证”这一病名。自此之后，已逐渐把情志之郁作为“郁证”的主要内容。PSD的发病机制尚不十分明确，目前多认为其发病机制与神经递质分泌异常有关，多种环境因素及认知障碍、躯体功能障碍等生物因素的叠加作用也促使PSD的发生，而脑损伤的部位与PSD的发生也有密切的关系［17］。有研究认为成纤维细胞生长因子－2表达水平下降也是引起PSD的原因之一［18］。目前抑郁症的生化机制研究已从神经递质及其受体转移到信号传导通路上，现多集中在抑郁症患者的G蛋白变化及相关的信号传导通路方面，而目前G蛋白介导的信息传导通路的研究热点是环磷酸腺苷通路和磷脂酰肌醇通路。本研究主要从cAMP通路入手观察行气调神针法治疗PSD的机制。

脑卒中可导致脏腑虚弱、情志内伤、肝气郁结，久则血瘀、痰浊等实邪内生，导致气机逆乱，扰及脑神、心神，致使脑失所控、神明失用。除了出现肢体活动障碍症状外，亦有精神恍惚、心神不宁、悲忧善哭、喜怒无常、失眠健忘等郁证表现［19］。本课题组通过长期临床总结，提出气机失调、脑神失控为PSD的主要病机，确立行气调神针法为PSD的治疗大法。

本针刺疗法选用合谷（双）、太冲（双）、人中。合谷为手阳明大肠经原穴，阳明经为多气多血之经，该穴具有调和气血、行气开窍、通降气机之效。太冲为足厥阴肝经原穴，有通经活络、舒肝理气、平肝熄风之效。《灵枢·九针十二原》云：“五脏有疾，当取之十二原。”《席弘赋》亦云：“手连肩脊痛难忍，合谷针时要太冲。”合谷、太冲并用，即“开四关”。合谷属阳，主气，太冲属阴，主血；二穴相配，一阴一阳，可调节人体气血阴阳的升降平衡。研究认为针刺双侧合谷和太冲可激活脑部多个区域，且并非是单独针刺两穴所激活脑区的简单叠加［20］。人中穴为督脉经穴，亦为手足阳明经和督脉的交会穴，具有开窍醒神和安神定志的作用。太冲、合谷、人中三穴合用，共奏行气调神之效。

PDE4作为cAMP的特异性水解酶，可以在不同的时间和空间调节cAMP浓度，对cAMP介导的信号反应区域化起重要的作用。而作为胞内第二信使的cAMP，是由cAMP信号通路上腺苷酸环化酶催化ATP生成，其具有调节细胞代谢生长和分裂、记忆形成、神经传递、基因表达等作用。另外cAMP可激活蛋白激酶A和蛋白激酶C亚基进入核内，使CREB转录因子特异的丝氨酸残端磷酸化而活化，磷酸化的CREB可以与cAMP反应元件结合，从而调节基因的转录。这些基因的一些蛋白质产物对学习记忆是必不可少的，因此在学习记忆中cAMP有非常重要的作用。因此通过抑制PDE4来增加cAMP的含量，促使CREB磷酸化，进而促进神经再生和神经细胞修复而发挥抗抑郁作用。

本研究结果显示，PSD大鼠左前皮质及海马CREB mRNA的表达显著减少，PDE4mRNA的表达显著高于其他各组；行气调神针刺疗法和盐酸氟西汀胶囊具有调节PSD大鼠左前皮质及海马CREB mRNA和PDE4mRNA表达的作用。本研究结果可为行气调神针刺疗法替代抗抑郁药物治疗PSD提供实验依据。

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