西洋参茎叶总皂苷对缺血/再灌注大鼠心肌线粒体膜电位及细胞凋亡的影响*

李 冬， 刘 蜜， 陶天琪， 宋丹丹， 刘秀华△， 史大卓

心肌细胞凋亡广泛存在于包括缺血性心脏病在内的多种心血管疾病中，对病情发展和预后起着重要作用［1-2］。在心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤过程中，细胞内氧化应激的发生、Ca2+稳态失衡等均会引起细胞损伤，加重细胞凋亡［3］。如何有效保护缺血心肌组织，减轻I/R损伤后的细胞凋亡，是目前医学研究领域的重要问题之一［4］。在心肌I/R损伤过程中，Ca2+超载和活性氧(reactive oxygen species，ROS)的大量产生会造成线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)不可逆开放，大量分子质量小于1.5 kD的物质通过线粒体内膜，使线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，ΔΨm)迅速降低，导致离子平衡失调，线粒体肿胀。mPTP开放使细胞色素C(cytochrome C，Cyt C)从线粒体释放入胞浆，激活线粒体凋亡通路，导致细胞凋亡、坏死，加重心肌损伤［5-6］。ΔΨm下降作为再灌注期mPTP开放后的特异性改变，能反映mPTP的开放程度，也是线粒体凋亡通路激活的早期变化之一［7］。

西洋参茎叶总皂苷(Panax quinquefolium saponin，PQS)是西洋参茎叶的主要活性成分。既往研究发现，PQS具有抗心肌缺血、减轻I/R损伤导致的心肌细胞凋亡［8-10］和改善心肌梗死后心室重构等作用［11］，其机制与抑制过度内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)［12-14］、增强抗氧化酶活性、减少细胞内Ca2+超载等有关［15］。PQS能否通过维持再灌注后心肌细胞ΔΨm的稳定、抑制线粒体凋亡通路激活而发挥对I/R心肌的保护作用?目前尚无相关研究。因此，本实验采用大鼠心肌I/R损伤模型，观察PQS对心肌I/R损伤后ΔΨm及线粒体凋亡通路的影响，探讨其保护I/R心肌和发挥抗凋亡作用的可能机制。

材料和方法

1 动物、试剂及仪器

清洁级健康雄性Sprague-Dawley大鼠，体质量(150±20)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司［许可证号为 SCXK(京)2012-0001］;PQS粉(纯度为99.0%)由吉林省集安益盛药业股份有限公司提供;环孢霉素A(cyclosporin A，CsA)购自诺华公司;末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记 (TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)试剂盒购自Promega;线粒体提取试剂盒购自凯基公司;兔抗人Bcl-2、Bax多克隆抗体和兔抗人Cyt C、GAPDH单克隆抗体均购自Cell Signal;兔抗人caspase-3多克隆抗体购自Merck Millipore;发光液Luminol Reagent购自Santa Cruz;其余化学试剂均购自Sigma-Aldrich;全自动生化分析仪(Cotas 8000，Roche);荧光酶标仪(Multiskan MK3，Thermo);激光共聚焦显微镜(FV1000，Olympus)。

2 I/R大鼠模型的制备和实验分组

SD大鼠90只，适应性喂养1周，术前禁食12 h，自由饮水，按照文献［16］报道的方法复制心肌I/R模型:以2%戊巴比妥钠(2.3 mL/kg)腹腔注射麻醉后，使大鼠仰卧位固定于手术台，气管插管，呼吸机辅助呼吸，记录标准导联心电图。胸骨正中切口，钝性分离皮下组织及肌肉，于胸骨左缘3～4肋间开胸，打开心包膜，分离脂肪垫，于左心耳下缘1 mm处以7号针线在冠状动脉左前降支 (left anterior descending coronary，LAD)下方穿缝合线，将充水(0.5 mL)的球囊垫于血管与结扎线间，结扎造成心肌缺血。心电图监测显示ST段抬高0.2 mV为造模成功，持续30 min后打开结扎线，抽出球囊，关胸，再灌注120 min。

健康成年SD大鼠 (280～320 g)，随机分为6组，每组15只。(1)假手术 (sham)组:与药物组等量纯净水灌胃，每天1次，连续6周;(2)模型(I/R)组:与Sham组灌胃方式相同，结扎LAD 30 min，再灌注120 min;(3)PQS+I/R组:PQS水溶液 (200 mg·kg-1·d-1)灌胃，每天1次，连续6周后行I/R组操作;(4)CsA组:再灌注开始前10 minCsA(10 mg·kg-1)腹腔注射，开胸后穿线，不结扎LAD;(5)CsA+I/R组:CsA(10 mg·kg-1)腹腔注射，余操作同I/R组;(6)PQS+CsA+I/R组:再灌注开始前10 min，CsA(10 mg·kg-1)腹腔注射，余操作同PQS+I/R组。复灌120 min后，经颈动脉插管取血用于血清LDH含量测定，每组随机选5只大鼠取全心行心梗面积检测，另10只分别沿心脏长轴横切心肌组织用甲醛固定制备组织切片，或取左室梗死危险区(area at risk，AAR)心肌组织迅速液氮冷冻后置于-80℃冰箱保存用于相关蛋白表达的检测，并按文献［17］报道的方法提取线粒体用于ΔΨm的测定。

3 方法

3.1 血清乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)含量测定 经颈动脉插管取血约10 mL，肝素抗凝，静止15～20 min后3 000 r/min离心10 min，收集血清，Eppendorf管分装，液氮速冻后转移至-80℃冰箱保存。以全自动生化分析仪(Roche)测定血清心肌损伤标志物LDH含量。

3.2 心肌梗死面积测定 按文献［18］报道的方法，从LAD结扎点结扎LAD，经主动脉逆行灌注1%伊文思蓝(Evans blue)2 mL，将非缺血区蓝染，显示出缺血区心肌组织，取出心脏，置于-20℃冰箱冷冻20 min，垂直心脏长轴横切成厚度均为2 mm左右的5片心脏切片，用丝线按顺序将其串起，置于2%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑 (2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)磷酸缓冲液中。37℃避光孵育30 min，置于10%甲醛溶液中过夜，封片。正常心肌组织呈蓝色，缺血非梗死区为红色，梗死区 (infarct size，IS)为灰白色，AAR为红色与灰白色区域之和。扫描仪扫描成像，以Image-Pro Plus图像分析软件(Version 4.1)计算各部分面积。参考文献［19］方法，缺血心肌面积用AAR面积与左心室 (left ventricle，LV)面积之比AAR/LV表示，梗死面积用IS/AAR表示。

3.3 心肌细胞凋亡测定 于左心室结扎部位以下垂直于心脏长轴横切厚约1 cm的心肌组织，置于10% 甲醛溶液中固定1周，常规石蜡包埋，制备3 μm切片，采用TUNEL法进行细胞凋亡检测［20］。激光共聚焦显微镜观察，正常心肌细胞核呈蓝色，凋亡细胞核呈深浅不一的绿色。每张切片于凋亡细胞分布区域随机取5个高倍视野 (×60)，计数每个视野中凋亡细胞数占总细胞数的百分比 (%)，以凋亡指数(apoptotic index，AI)表示。

3.4 线粒体提取 依照线粒体提取试剂盒要求进行操作:取各组复灌120 min大鼠左室前壁AAR区心肌组织150 mg，用剪刀将其剪成2 mm×2 mm×2 mm大小碎块放入冰水浴的玻璃匀浆器内，加入1.5 mL lysis buffer，上下研磨，将充分磨碎的组织液4℃离心5 min(800×g)，取上清0.5 mL加入0.5 mL medium buffer，4 ℃离心10 min(15 000 ×g)，离心后的上清含胞浆成分，将其留取后存于-80℃冰箱，沉淀物即为线粒体。向线粒体沉淀中加入0.2 mL wash buffer，以吸管吹打成悬液，4℃离心10 min(15 000×g)，弃上清。向沉淀物中加入0.l mL store buffer，重悬后于 -80℃冰箱保存用于ΔΨm检测。

3.5 ΔΨm测定 以阳离子荧光染色剂羰花青 (5，5′，6，6′-tetrachloro-1，1′，3，3′-tetraethyl benzimidalyl carbocyanine iodide，JC-1)标记线粒体，参照文献［21］方法进行检测。将 -80℃保存的线粒体悬液取出，冰槽内融化，用ΔΨm反应缓冲液 (0.21 mol/L甘露醇，0.07 mol/L蔗糖，5 mmol/L HEPES，pH 7.4)悬浮线粒体悬液 (含线粒体蛋白50 μg)，缓冲体系为2 mL。加入1 μL解偶联剂羰基氰化物间氯苯腙(carboxyl cyanidem chlorophenylhydrazone，CCCP)30℃ 10 min，随后加入0.2 mmol/L JC-1染色液3 μL，室温避光孵育10 min，进行ΔΨm测定。取100 μL上述反应液移至载玻片上，在激光共聚焦显微镜下进行观察(单滤波):激发波长490 nm，散发波长590 nm，可见亮红色荧光，如荧光强度显著减弱，表明ΔΨm受到破坏。另取100 μL加入96孔板各孔中，即刻放进荧光酶标仪测定，检测激发波长490 nm、散发波长590 nm下的荧光强度，结果以相对荧光单位(relative fluorescence unit，RFU)表示。

3.6 Western blotting 取大鼠左室前壁心肌组织(AAR区)40 mg，按文献［22］报道方法提取总蛋白，与分离线粒体后留取的含胞浆成分的上清一起，用BCA法进行蛋白定量，-80℃冰箱保存。取上述蛋白提取液(含蛋白80 μg)进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，12%分离胶)。电泳分离后的蛋白电转移至硝酸纤维素膜上，5%BSA封闭1 h，分别加入Bcl-2、Bax、Cyt C 和 GAPDH 单克隆抗体 (1∶1 000)和caspase-3多克隆抗体 (1∶100)4℃ 过夜孵育，其中caspase-3抗体可同时识别caspase-3酶原 (procaspase-3，分子量为32 kD)和剪切后的 caspase-3(cleaved caspase-3，分子量为17 kD);用1×TBST洗膜后，相应Ⅱ抗孵育1 h。化学发光ECL显示蛋白条带，采用Image-Pro Plus 4.1软件分析蛋白条带的吸光度［integrated absorbance，IA=平均吸光度(A)×面积］，以靶蛋白IA与GAPDH IA的比值反映靶蛋白水平。

4 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件处理。数据用均数±标准差 (mean±SD)表示，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行多组间比较，q检验进行多组间两两比较;用卡方检验(Chi-square test)进行率的比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 PQS对心肌I/R损伤的影响

1.1 血清LDH I/R组血清LDH含量显著升高，为sham组的1.06倍(P＜0.05)，CsA组LDH含量与sham组比较无显著差异(P＞0.05);与I/R组比较，PQS+I/R、CsA+I/R及 PQS+CsA+I/R组血清LDH含量分别降低38.2%、31.0%和39.3%(P＜0.05);CsA+I/R组、PQS+CsA+I/R组 LDH含量与PQS+I/R组比较无显著差异 (P＞0.05)，见图1。

Figure 1.Effect of PQS on serum activity of LDH after I/R.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs I/R.图1 PQS对血清LDH含量的影响

1.2 心肌梗死面积 Sham组AAR/LV为(43.8±3.1)%，I/R组为(47.1±4.6)%，PQS+I/R组为(42.3±4.8)%，CsA组为(43.1±7.7)%，CsA+I/R组为(45.5±5.9)%，PQS+CsA+I/R组为(43.6±4.9)%，组间无显著差异(P＞0.05);sham组和CsA组大鼠无心肌梗死，I/R组 IS/AAR为(42.4±3.0)%;与I/R组相比，PQS+I/R组、CsA+I/R组和PQS+CsA+I/R组IS/AAR分别降低50.3%、38.7%和39.4%(P ＜0.05)，PQS+I/R、CsA+I/R和PQS+CsA+I/R组间IS/AAR无显著差异(P＞0.05)，见图 2。

Figure 2.The effect of PQS on myocardial infarct size in the rats with Evans blue and TTC staining.Mean±SD.n=5.#P＜0.05 vs I/R.图2 PQS对心肌梗死面积的影响

1.3 心肌细胞凋亡 与sham组比较，I/R组心肌细胞AI升高6.08倍 (P＜0.05)，CsA组AI无显著差异 (P＞0.05);与I/R组比较，PQS+I/R组、CsA+I/R组和PQS+CsA+I/R组心肌细胞AI分别降低40.7%、46.4%和39.1%(P ＜0.05)，PQS+I/R、CsA+I/R和PQS+CsA+I/R组间AI无显著差异(P ＞0.05)，见图3。

2 PQS对ΔΨm的影响

激光共聚焦显微镜下观察显示，sham组线粒体红色荧光强度较高，与sham组相比，I/R组荧光强度减弱，CsA组荧光强度无明显变化;与I/R组相比，PQS+I/R组、CsA+I/R组和PQS+CsA+I/R组线粒体红色荧光均显著增强。荧光酶标仪结果显示，sham组RFU值为23.2±4.0，I/R组 RFU值为8.9±2.2，和sham组相比降低61.3%(P＜0.05)，CsA组RFU值与sham组无显著差异(P＞0.05);PQS+I/R组、CsA+I/R组和PQS+CsA+I/R组 RFU值分别为14.7±3.3、16.9±0.9和16.1±3.7，较 I/R组升高64.2%、88.3%和79.4%(P＜0.05)，3组间RFU值无显著差异 (P＞0.05)，见图4。

3 PQS对凋亡因子Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

Figure 3.The effect of PQS on cardiomyocyte apoptotic index(TUNEL staining，×60，scale bar=20 μm).Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs I/R.图3 PQS对大鼠心肌细胞凋亡指数的影响

与sham组比较，I/R组 Bcl-2蛋白表达降低65.1%(P＜0.05)，Bax为 sham组的2.3倍 (P＜0.05);CsA组Bcl-2和Bax蛋白表达与Sham组比较均无显著差异(P＞0.05);与I/R组相比，PQS+I/R组、CsA+I/R组和PQS+CsA+I/R组Bcl-2表达量分别为I/R组的1.9、1.8和2.0倍(P＜0.05)，Bax蛋白表达分别较 I/R组降低46.3%、44.6%和48.7%(P＜0.05);PQS+I/R、CsA+I/R和 PQS+CsA+I/R组Bcl-2和 Bax蛋白表达无显著差异(P ＞0.05)，见图5。

Figure 4.The effect of PQS on mitochondrial membrane potential(×600，scale bar=20 μm).A:sham group;B:I/R group;C:PQS+I/R group;D:CsA group;E:CsA+I/R group;F:PQS+CsA+I/R group.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs I/R.图4 PQS对大鼠心肌细胞线粒体膜电位的影响

Figure 5.The effect of PQS on the expression of pro-apoptotic protein Bax and anti-apoptotic protein Bcl-2 in I/R myocardium.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs I/R.图5 PQS对I/R心肌组织Bcl-2和Bax蛋白表达的影响

4 PQS对Cyt C蛋白表达的影响

与sham组相比，I/R组大鼠心肌组织胞浆中Cyt C蛋白表达量升高1.77倍 (P＜0.05)，CsA组胞浆Cyt C蛋白表达无显著差异 (P＞0.05);与I/R组比较，PQS+I/R组、CsA+I/R组和PQS+CsA+I/R组胞浆Cyt C蛋白表达量分别降低29.7%、32.5%和28.9%(P＜0.05);PQS+I/R、CsA+I/R和 PQS+CsA+I/R组间胞浆Cyt C蛋白表达无显著差异(P ＞0.05)，见图6。

Figure 6.The effect of PQS on the expression of cytosolic Cyt C in I/R myocardium.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs I/R.图6 PQS对I/R心肌组织胞浆中Cyt C蛋白表达的影响

5 PQS对cleaved caspase-3蛋白表达的影响

结果显示，各组pro-caspase-3蛋白表达无明显差异(P＞0.05);与sham组比较，I/R组可明显诱导大鼠心肌组织caspase-3蛋白剪切活化，其cleaved caspase-3蛋白表达水平显著增加，为sham组的2.6倍(P＜0.05)，CsA组较sham组无明显变化 (P＞0.05);与I/R组相比，PQS+I/R组、CsA+I/R组和PQS+CsA+I/R组cleaved caspase-3蛋白表达量分别降低53.3%、47.3%和45.1%(P＜0.05);PQS+I/R、CsA+I/R和PQS+CsA+I/R组间无显著差异 (P＞0.05)，见图7。

讨 论

本实验结果显示，I/R可造成大鼠心肌细胞损伤，使血清LDH水平上升，心梗面积增大，细胞凋亡增多，ΔΨm下降，线粒体凋亡通路激活;PQS具有抗心肌I/R损伤作用，表现为降低I/R大鼠血清LDH水平，缩小心肌梗死面积，减少心肌细胞凋亡，抑制再灌注期ΔΨm降低，升高Bcl-2/Bax蛋白表达，减少Cyt C和cleaved caspase-3蛋白表达，提示PQS的I/R心肌保护作用与维持再灌注期ΔΨm稳定、抑制mPTP开放并减少mPTP开放后线粒体凋亡通路的激活有关。

Figure 7.The effect of PQS on the expression of apoptotic effector enzyme caspase-3 in I/R myocardium.Mean±SD.n=8.*P＜0.05 vs sham;#P＜0.05 vs I/R.图7 PQS对I/R心肌组织caspase-3活化的影响

心肌I/R损伤时细胞膜通透性增加，心肌酶漏出，LDH作为灵敏度较高的心肌酶之一，其含量变化能较准确地反映心肌损伤程度。本实验结果显示，PQS能显著降低I/R后血清LDH含量，表明PQS可减轻I/R心肌损伤。心梗面积是反映心肌损伤程度的金指标［23］，与I/R组相比，PQS能明显缩小大鼠心梗面积，说明PQS对I/R心肌具有保护作用。

细胞凋亡是心肌I/R损伤的一个重要形式［24-25］。与缺血期相比，缺血后再灌注可加速细胞凋亡［26］，且凋亡细胞主要存在于梗死周边的心肌组织中［27］。本研究选用大鼠心肌AAR区进行TUNEL染色，显示I/R能使凋亡细胞数量显著增加，PQS治疗可明显降低凋亡细胞数量，AI值较I/R组下降，说明PQS具有抗I/R心肌细胞凋亡作用，与以往报道一致［13］。

在I/R过程中，线粒体基质内ROS的大量产生、Ca2+超载等均会造成线粒体肿胀，ΔΨm下降，mPTP开放［28-29］。mPTP开放又可进一步降低 ΔΨm，造成线粒体呼吸链解偶联，mPTP不可逆开放［30］;ΔΨm是衡量线粒体功能和mPTP开放程度的重要指标之一［31］。mPTP不可逆开放可使Cyt C从损伤的线粒体外膜向胞浆释放，与凋亡蛋白酶活化因子1和caspase-9的蛋白前体形成凋亡小体，在dATP的辅助下激活caspase-9，使caspase-3活化，启动caspase级联凋亡反应，加剧I/R后的心肌细胞损伤［32-34］。作为线粒体凋亡通路下游的关键分子，caspase-3活化后的剪切形式cleaved caspase-3可反映细胞凋亡水平［35］。另外，Bcl-2家族在线粒体凋亡通路的激活中也发挥关键作用［36］。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中的重要成员，Bcl-2主要分布于线粒体外膜、内质网和核周膜，抑制细胞凋亡;Bax主要存在于胞质中，促进细胞凋亡。Bax能与mPTP的腺嘌呤核苷酸转位酶(adenine nucleotide translocase，ANT)成分结合，导致mPTP开放，而 Bcl-2能抑制Bax和ANT的结合作用，Bcl-2/Bax对mPTP的调控位于线粒体凋亡通路的上游，也对mPTP开放及继后的凋亡激活起到重要作用［37］。本研究通过激光共聚焦显微镜及荧光酶标仪对ΔΨm进行检测，发现I/R能使心肌ΔΨm显著降低，PQS能明显提高心肌I/R损伤后ΔΨm水平;Western blotting结果显示，与I/R组相比，PQS能使心肌Bcl-2蛋白表达升高，Bax、cleaved caspase-3和胞浆Cyt C蛋白表达下降。该结果提示，PQS能抑制再灌注期ΔΨm下降，并减少mPTP开放后线粒体凋亡通路的激活。

CsA是效果明确的mPTP特异性抑制剂，它可通过与mPTP上亲环蛋白D(cyclophilin D，CyP-D)结合，抑制mPTP开放［38-40］。但作为具有免疫抑制作用的药物，CsA也可引起严重的不良反应，如高血压、钾潴留、高钾血症和肝、肾功能衰竭等，限制了其临床应用［41］。本研究结果显示，CsA能降低I/R后血清LDH含量，减小心梗面积，减少心肌细胞凋亡，稳定ΔΨm水平，升高Bcl-2蛋白表达，降低 Bax、Cyt C和cleaved caspase-3蛋白表达，但与PQS组比较无显著差异。此外，与PQS或CsA单独使用比较，PQS与CsA联合应用对以上各指标的作用亦无显著差异，说明PQS和CsA对I/R心肌的保护作用、抗凋亡作用与对再灌注期ΔΨm的调控效果类似。

［1］ Bialik S，Cryns VL，Drincic A，et al.The mitochondrial apoptotic pathway is activated by serum and glucose deprivation in cardiac myocyte［J］.Circ Res，1999，85(5):403-414.

［2］ Black SC，Huang JQ，Rezaiefar P，et al.Co-localization of the cysteine protease caspase-3 with apoptotic myocytes after in vivo myocardial ischemia and reperfusion in the rat［J］.J Mol Cell Cardiol，1998，30(4):733-742.

［3］ Hausenloy DJ，Yellon DM.The evolving story of“conditioning”to protect against acute myocardial ischemiareperfusion injury［J］.Heart，2007，93(6):649-651.

［4］ Yellon DM，Hausenloy DJ.Myocardial reperfusion injury［J］.N Engl J Med，2007，357(11):1121-1135.

［5］ Di Lisa F，Canton M，Menabò R，et al.Mitochondria and cardioprotection［J］.Heart Fail Rev，2007，12(3-4):249-260.

［6］ Kinnally KW，Peixoto PM，Ryu SY，et al.Is mPTP the gatekeeper for necrosis，apoptosis，or both?［J］.Biochim Biophys Acta，2011，1813(4):616-622.

［7］ Zamzami N，Marchetti P，Castedo M，et al.Reduction in mitochondrial potential constitutes an early irreversible step of programmed lymphocyte death in vivo［J］.J Exp Med，1995，181(5):1661-1672.

［8］ 王承龙，史大卓，殷惠军，等.西洋参茎叶总皂苷对急性心肌梗死大鼠心肌VEGF、bFGF表达及血管新生的影响［J］.中国中西医结合杂志，2007，27(4):331-334.

［9］ 王承龙，缪 宇，殷惠军，等.西洋参茎叶总皂苷对急性心肌梗死大鼠心肌能量代谢的影响［J］.中华老年心脑血管病杂志，2005，7(5):341-343.

［10］殷惠军，张 颖，蒋跃绒，等.西洋参叶总皂苷对急性心肌梗死大鼠心肌细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响［J］.中国中西医结合杂志，2005，25(3):232-235.

［11］李广阔，范金爽，李焕明.西洋参茎叶总皂苷对心室重构大鼠的保护作用［J］.中国老年学杂志，2011，31(12):4634-4636.

［12］ Wang C，Li YZ，Wang XR，et al.Panax quinquefolium saponins reduce myocardial hypoxia-reoxygenation injury by inhibiting excessive endoplasmic reticulum stress［J］.Shock，2012，37(2):228-233.

［13］王 琛，刘 蜜，孙 胜，等.西洋参茎叶总皂苷通过抑制过度内质网应激减轻大鼠心肌缺血/再灌注损伤［J］.中国病理生理杂志，2013，29(1):20-27.

［14］Liu M，Wang XR，Wang C，et al.Panax quinquefolium saponin attenuates ventricular remodeling after acute myocardial infarction by inhibiting CHOP-mediated apoptosis［J］.Shock，2013，40(4):339-344.

［15］鞠传静，张志国，赵学忠，等.西洋参叶二醇组皂甙对大鼠实验性心室重构的保护作用［J］.中国老年学杂志，2007，27(22):2173-2175.

［16］赵秀梅，孙 胜，刘秀华.垫扎球囊法复制大鼠在体心肌缺血/再灌注模型［J］.中国微循环，2007，11(3):206-208.

［17］ Siripong P，Punate W，Kroekkiat C，et al.Mechanisms responsible for beneficial and adverse effects of rosiglitazone in a rat model of acute cardiac ischemia-reperfusion［J］.Exp Physiol，2013，98(5):1028-1037.

［18］ Liu XH，Grund F，Kanellopoulos GK，et al.Myocardial extracellular signal regulatory kinases are activated by laser treatment［J］.J Cardiovasc Surg(Torino)，2003，44(1):1-7.

［19］ Redel A，Jazbutyte V，Smul TM，et al.Impact of ischemia and reperfusion times on myocardial infarct size in mice in vivo［J］.Exp Biol Med，2008，233(1):84-93.

［20］ Gavrieli Y，Sherman Y，Ben-Sasson SA.Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation［J］.J Cell Biol，1992，119(3):493-501.

［21］ Hassouna A，Loubani M，Matata BM，et al.Mitochondrial dysfunction as the cause of the failure to precondition the diabetic human myocardium［J］.Cardiovasc Res，2006，69(2):450-458.

［22］ Xu FF，Liu XH，Cai LR.Role of hypoxia-inducible factor-1 in the prevention of cardiomyocyte injury induced by hypoxic preconditioning［J］.Acta Physiol Sin，2004，56(5):609-614.

［23］张 雷，顾尔伟，刘训芹，等.乳化异氟醚后处理对兔在体心脏缺血/再灌注损伤的保护作用［J］.中国药理学通报，2009，25(10):1322-1326.

［24］ Fliss H，Gattinger D.Apoptosis in ischemic and reperfused rat myocardium［J］.Circ Res，1996，79(5):949-956.

［25］ Krijnen PA，Nijmeijer R，Meijer CJ，et al.Apoptosis in myocardial ischaemia and infarction［J］.J Clin Pathol，2002，55(11):801-811.

［26］ Haunstetter A，Izumo S.Apoptosis:basic mechanisms and implications for cardiovascular disease［J］.Circ Res，1998，82(11):1111-1129.

［27］ Scarabelli TM，Gottlieb RA.Functional and clinical repercussions of myocyte apoptosis in the multifaceted damage by ischemia/reperfusion injury:old and new concepts after 10 years of contributions［J］.Cell Death Differ，2004，11(Suppl 2):S144-S152.

［28］ Lemasters JJ，Qian T，He L，et al.Role of mitochondrial inner membrane permeabilization in necrotic cell death，apoptosis，and autophagy［J］.Antioxid Redox Signal，2002，4(5):769-781.

［29］ Baines CP.The mitochondrial permeability transition pore and ischemia-reperfusion injury［J］.Basic Res Cardiol，2009，104(2):181-188.

［30］ Halestrap AP，Clarke SJ，Javadov SA.Mitochondrial permeability transition pore opening during myocardial reperfusion:a target for cardioprotection［J］.Cardiovasc Res，2004，61(3):372-385.

［31］ Halestrap AP，McStay GP，Clarke SJ.The permeability transition pore complex:another view［J］.Biochimie，2002，84(2-3):153-166.

［32］ Huttemann M，Helling S，Sanderson TH，et al.Regulation of mitochondrial respiration and apoptosis through cell signaling:cytochrome c oxidase and cytochrome c in ischemia/reperfusion injury and inflammation［J］.Biochim Biophys Acta，2012，1817(4):598-609.

［33］ Nakagawa T，Shimizu S，Watanabe T，et al.Cyclophilin D-dependent mitochondrial permeability transition regulates some necrotic but not apoptotic cell death［J］.Nature，2005，434(7033):652-658.

［34］ Gateau-Roesch O，Argaud L，Ovize M.Mitochondrial permeability pore and postconditioning［J］.Cardiovasc Res，2006，70(2):264-273.

［35］Uchiyama T，Otani H，Okada T，et al.Nitric oxide induced caspase-dependent apoptosis and necrosis in neonatal rat cardiomyocytes［J］.J Mol Cell Cardiol，2002，34(8):1049-1061.

［36］ Lee Y，Gustafsson AB.Role of apoptosis in cardiovascular disease［J］.Apoptosis，2009，14(4):536-548.

［37］高 琴，姜翠荣，于 影，等.线粒体乙醛脱氢酶2在心肌缺血后处理中的作用［J］.中国药理学通报，2010，26(8):1088-1092.

［38］ Crompton M，Ellinger H，Costi A.Inhibition by cyclosporin A of a Ca2+-dependent pore in heart mitochondria activated by inorganic phosphate and oxidative stress［J］.Biochem J，1988，255(1):357-360.

［39］ Halestrap AP，Davidson AM.Inhibition of Ca2+-induced large-amplitude swelling of liver and heart mitochondria by cyclosporin is probably caused by the inhibitor binding to mitochondrial-matrix peptidyl-prolylcis-transisomerase and preventing it interacting with the adenine nucleotide translocase［J］.Biochem J，1990，268(1):153-160.

［40］ Griffiths EJ，Halestrap AP.Further evidence that cyclosporine A protects mitochondria from calcium overload by inhibiting a matrix peptidyl-prolyl cis-trans isomerase.Implications for the immunosuppressive and toxic effects of cyclosporine［J］.Biochem J，1991，274(Pt 2):611-614.

［41］ Li J，Iorga A，Sharma S，et al.Intralipid，a clinically safe compound，protects the heart against ischemia-reperfusion injury more efficiently than cyclosporine-A［J］.Anesthesiology，2012，117(4):836-846.