Akt激酶抑制剂MK-2206诱导U2OS人骨肉瘤细胞凋亡与自噬*

王雪莹， 李照梅， 周运生， 郭文莉， 王凤泽△

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)信号通路参与细胞的增殖、凋亡和分化等多种生命活动过程［1-2］。PI3K和其下游分子蛋白激酶B(protein kinase B，PKB或Akt)所构成的信号途径与肿瘤细胞的凋亡、迁移、自噬以及细胞外基质的降解等关系密切［3］。抑制PI3K/Akt途径的过度活化可诱导细胞程序性死亡和抑制肿瘤的生长［4］。因此，PI3K/Akt已经成为一个很有希望的抗肿瘤治疗靶点。MK-2206是Akt的新型抑制剂，表现出良好的抑制多种肿瘤的活性［5-6］。本研究以骨肉瘤细胞U2OS为实验材料，检测MK-2206对骨肉瘤细胞凋亡和自噬的影响，为MK-2206的临床用药提供理论依据。

材料和方法

1 细胞株和主要试剂

人骨肉瘤细胞株U2OS购自上海中科院细胞库，生长于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37℃、5%CO2条件下培养。

MK-2206购自Selleck Chemicals;DMEM培养基和胎牛血清购自Gibco;MTT和氯喹购自Sigma;DNA片段末端标记法(TUNEL)凋亡检测试剂盒购自Roche;ECL试剂盒购自Thermo Scientific Pierce;Caspase-3抗体、caspase-9抗体、PARP抗体和Atg5抗体购自Cell Signaling Technology;β-actin和LC3-II抗体购自Sigma;Ⅱ抗均购自北京中杉金桥。

2 方法

2.1 MTT法测定细胞活性 将U2OS细胞接种于96孔板中，加入不同剂量的MK-2206处理24 h，对照组加入DMSO;终止培养前4 h加20 μL MTT(5 g/L)于各个孔中，吸去培养液并加入150 μL DMSO，室温振荡5 min后在490 nm波长下测定吸光度值。

2.2 TUNEL法检测细胞凋亡 细胞经MK-2206处理24 h后，PBS洗涤细胞3次，接着4℃固定细胞1 h，0.1%Triton X-100打孔2 min。然后按照TUNEL凋亡检测试剂盒说明书对细胞进行凋亡染色，倒置荧光显微镜观察细胞TUNEL染色结果。

2.3 免疫印迹分析 细胞用RAPI裂解液冰上裂解20 min，然后4℃、13 000×g离心20 min，收集上清定量。取30 μg总蛋白进行SDS-PAGE，然后电转移至硝酸纤维素膜上，膜用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入Ⅰ抗室温孵育2 h，接着加入Ⅱ抗室温孵育1 h，最后ECL显色试剂盒于暗室曝光显影。实验重复3次。

2.4 细胞内GFP-LC3融合蛋白的表达 将GFPLC3质粒和Lipofectamine 2000以适当的比例稀释于无血清Opti-MEM培养基中，混匀后室温孵育30 min，然后加入经Opti-MEM洗涤后的U2OS细胞中。在5%CO2孵箱内37℃孵育6 h后更换新的含10%胎牛血清的DMEM培养液继续培养。转染24 h后，加入不同浓度的MK-2206继续处理24 h，然后弃去培养液，用PBS洗涤细胞2次，倒置荧光显微镜下观察并拍照。

3 统计学处理

数据以均数±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0统计软件分析。组间均数比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 MK-2206显著抑制U2OS细胞活性

用不同剂量的MK-2206处理U2OS细胞24 h后，细胞活性受到明显的抑制，且MK-2206对U2OS细胞活性的抑制作用呈剂量依赖性，见图1。

Figure 1.MK-2206 reduced the viability of U2OS cells.The cells were seeded at a density of 1×109cells/L in 96-well culture plates at 37℃for 1 d.After 24 h of incubation，the cells were incubated with MK-2206 for 24 h and then processed for MTT assay.Mean±SD.n=6.图1 MK-2206降低U2OS细胞的活力

2 MK-2206诱导U2OS细胞发生凋亡

TUNEL结果显示，骨肉瘤细胞U2OS经MK-2206作用24 h后，细胞发生明显的凋亡现象，见图2。

Figure 2.Effect of MK-2206 on the apoptosis of U2OS cells.The cells were treated with different concentrations of MK-2206 for 24 h.The apoptosis was analyzed by TUNEL staining.The results showed the presence of fragmented DNA(TUNEL-positive staining，bright green in color)in MK-2206-treated U2OS cells.图2 MK-2206诱导U2OS细胞发生凋亡

免疫印迹结果发现，MK-2206能够促进U2OS细胞内caspase-3、caspase-9和PARP的活性切割，见图3，表明 MK-2206诱导骨肉瘤细胞的凋亡与激活caspases家族成员的活性密切相关。

Figure 3.MK-2206 treatment induced the cleavage of caspase-3，caspase-9 and PARP at 24 h.β-actin was used as a control.CF:cleaved fragment.图3 MK-2206诱导caspase-3、caspase-9和PARP发生活性切割

3 MK-2206诱导U2OS细胞发生自噬

转染GFP-LC3质粒的U2OS细胞经MK-2206作用后，细胞内LC3呈现明显的点状聚集，而对照组绿色荧光呈弥散分布，见图4。

用免疫印迹法检测了MK-2206对骨肉瘤细胞内LC3-II和Atg5蛋白表达量的影响，发现不同浓度的MK-2206处理U2OS细胞后，与对照组相比，LC3-II和Atg5的蛋白表达水平明显增多，见图5。

4 阻断自噬促进MK-2206对U2OS细胞活性的抑制作用

氯喹是一种自噬抑制剂，能有效抑制细胞自噬的发生。骨肉瘤细胞经氯喹预处理后，MK-2206对U2OS细胞活性的抑制作用进一步增强，见图6。

讨 论

我们前期研究发现Akt抑制剂MK-2206能够诱导肝癌细胞发生凋亡，但其在骨肉瘤细胞中的抑癌活性未见报道。本研究在检测MK-2206降低U2OS细胞活性并诱导细胞发生凋亡的同时探讨了MK-2206对细胞自噬的影响。本研究结果表明，MK-2206能够抑制骨肉瘤细胞U2OS的细胞活性，且抑制作用呈剂量依赖性;经 MK-2206作用24 h后，U2OS细胞发生明显的凋亡现象，调控细胞凋亡线粒体途径的caspases家族部分蛋白出现明显的活性切割。同时，我们观察到自噬标记分子LC3-II的表达水平升高，提示MK-2206可能诱导细胞发生自噬;GFP-LC3细胞内的点状分布进一步证实了MK-2206能够诱导骨肉瘤细胞自噬的发生。

Figure 4.Induction of autophagy in MK-2206-treated U2OS cells.The formation of LC3-positive vesicles in MK-2206-treated and GFP-LC3-transduced cells was observed.MK-2206 induced the redistribution of GFP-LC3 from diffused distribution(control cells)to punctate structures(MK-2206-treated cells).图4 MK-2206对U2OS细胞自噬的诱导作用

Figure 5.MK-2206 increased the expression of LC3-II and Atg5 in the U2OS cells.Cells were treated with indicated concentrations of MK-2206 for 24 h and then subjected to detect the levels of LC3-II and Atg5 by Western blotting.Bands were analyzed by Glyco Band-Scan software.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 μmol/L.图5 MK-2206促进U2OS细胞内LC3-II和Atg5的表达

Figure 6.The effects of autophagic inhibitor chloroquine(CQ)on MK-2206-reduced cell viability.The cells were treated with 20 μmol/L CQ for 2 h before the addition of MK-2206 at concentration of 10 μmol/L(MK10)or 20 μmol/L(MK20).The cell viability was determined by MTT assay after 24h.Mean±SD.n=6.图6 MK-2206联合自噬抑制剂氯喹对细胞活性的影响

细胞自噬是真核细胞所特有的一种生物学过程，是细胞内的物质成分利用溶酶体被降解过程的统称［7-8］。细胞发生自噬时，自噬体与溶酶体相结合形成自噬溶酶体，后者可降解细胞内受损的细胞器，同时循环利用降解的产物，为细胞代谢提供营养物质及原料。近年来的研究显示，自噬在肿瘤的预防治疗中有重要作用。自噬与细胞凋亡关系复杂，表现在自噬既可诱导凋亡，又可拮抗细胞的凋亡，自噬的这种双重作用机制使其在肿瘤细胞中的功能尤为重要［9-10］。

为了探讨MK-2206诱导的U2OS细胞自噬与细胞活性的相关性，我们应用自噬特异抑制剂氯喹来观察自噬的发生对MK-2206抑制细胞活性的影响。实验结果可见，经氯喹预处理后，MK-2206对细胞活性的抑制作用明显增强，表明MK-2206诱导的细胞自噬可能对U2OS细胞起保护作用。

综上所述，MK-2206抑制人骨肉瘤U2OS细胞的活性与其促进细胞凋亡及诱导自噬相关。目前，自噬与肿瘤发生的相关性尚未完全阐述清楚，对自噬的深入研究很可能为癌症的治疗提供新的途径。MK-2206和自噬抑制剂的联合应用可能为骨肉瘤的临床治疗提供新策略。

［1］ 费洪荣，陈洪蕾，辛晓明，等.Akt抑制剂perifosine抑制胃癌细胞增殖并诱导凋亡的实验研究［J］.中国病理生理杂志，2011，27(6):1084-1089.

［2］ Agarwal E，Brattain MG，Chowdhury S.Cell survival and metastasis regulation by Akt signaling in colorectal cancer［J］.Cell Signal，2013，25(8):1711-1719.

［3］ Sheppard K，Kinross KM，Solomon B，et al.Targeting PI3 kinase/AKT/mTOR signaling in cancer［J］.Crit Rev Oncog，2012，17(1):69-95.

［4］ 王海燕，邹正渝，段 亮，等.S100A6通过PI3K/Akt信号通路促进人骨肉瘤细胞143B增殖和迁移［J］.中国病理生理杂志，2013，29(11):1928-1933.

［5］ Almhanna K，Cubitt CL，Zhang S，et al.MK-2206，an Akt inhibitor，enhances carboplatinum/paclitaxel efficacy in gastric cancer cell lines［J］.Cancer Biol Ther，2013，14(10):932-936.

［6］ Jiao P，Zhou YS，Yang JX，et al.MK-2206 induces cell cycle arrest and apoptosis in HepG2 cells and sensitizes TRAIL-mediated cell death［J］.Mol Cell Biochem，2013，382(1-2):217-224.

［7］ Jutten B，Rouschop KM.EGFR signaling and autophagy dependence for growth，survival，and therapy resistance［J］.Cell Cycle，2014，13(1):42-51.

［8］ Deretic V，Saitoh T，Akira S.Autophagy in infection，inflammation and immunity［J］.Nat Rev Immunol，2013，13(10):722-737.

［9］ Mariño G，Niso-Santano M，Baehrecke EH，et al.Selfconsumption:the interplay of autophagy and apoptosis［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2014，15(2):81-94.

［10］Han J，Hou W，Goldstein LA，et al.A complex between Atg7 and caspase-9:a novel mechanism of cross-regulation between autophagy and apoptosis［J］.J Biol Chem，2013，289(10):6485-6497.