响应面法优化超声波辅助提取豹皮樟多酚工艺

张宇思，王成章，2* ，舒阿庆，叶建中

(1.中国林业科学研究院林产化学工业研究所;生物质化学利用国家工程实验室;国家林业局林产化学工程重点开放性实验室;江苏省生物质能源与材料重点实验室，江苏 南京 210042;2.中国林业科学研究院林业新技术研究所，北京 100091;3.宁国市亿邦生物科技有限公司，安徽 宁国 242300)

豹皮樟(Litsea coreana var.sinensis(Allen)Yang et H.P.Huang)是樟科木姜子属植物，分布于安徽、浙江、四川、贵州、云南等地［1］。豹皮樟鲜叶经加工后可作为一种植物代用茶，俗称老鹰茶、白茶，为我国南方民间长期饮用，具有解毒消肿、明目益思、生津止渴、解表防暑的功效，是一种无毒副作用、无污染、风味较佳的纯天然野生饮品［2］。研究表明，豹皮樟中含有多种人体所需的氨基酸、矿物元素、维生素［3］，还含有黄酮类、多酚类、皂苷等多种生物活性成分，具有抗氧化、降血糖、降血脂、保肝护肝、抗炎及免疫调节等作用［4］。目前关于豹皮樟活性成分的研究报道主要集中在黄酮类、皂苷、挥发油上［5-7］，对豹皮樟多酚的研究报道较少。植物多酚也称单宁，是一类广泛存在于植物体内的天然大分子化合物，对人的营养和健康有着重要的影响，随着研究的深入，植物多酚在医学、食品、制革工业、日用化工等方面都表现出了越来越重要的作用［8］。超声波提取方法由于操作简单快捷，提取率高，提取温度低，提取物的结构不易被破坏等特点，在热敏成分的提取中有明显的优势，已被广泛用于植物多酚的提取［9-10］。响应面法作为一种现代试验设计优化方法，优于线性回归分析和正交试验设计，可在给定范围内找到影响因素与响应值之间明确的函数表达式，找到最佳的因素组合和最优响应值，目前已成为降低成本、优化加工条件的一种有效方法，广泛地应用于农业、生物、食品、化工等领域［11］。本研究在单因素试验的基础上，采用响应面法优化超声波辅助提取豹皮樟多酚工艺，旨在为豹皮樟资源的综合开发利用提供科学依据。

1 实验

1.1 材料与仪器

豹皮樟(Litsea coreana var.sinensis(Allen)Yang et H.P.Huang)叶，2013年5月采自安徽宁国，阴干后粉碎备用;没食子酸，福林酚试剂，均为国产分析纯。

Xo-1200超声波细胞破碎仪，南京先欧仪器制造有限公司;UNICO UV-2102PC型紫外可见分光光度计，上海精密仪器仪表有限公司;WK-400A型高速药物粉碎机;H-1650高速台式离心机。

1.2 试验方法

1.2.1 标准曲线的绘制［12］分别量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 质量浓度为0.1 g/L 的没食子酸标准溶液于10 mL容量瓶中，各自加入1 mL福林酚试剂和2 mL质量分数为15%的Na2CO3溶液，然后加入蒸馏水补齐至刻度，室温避光静置60 min，于760 nm处测定吸光度值。以吸光度(Y)为纵坐标，没食子酸质量浓度 X，(g/L)为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为:Y=6.895X+0.046 5，相关系数R=0.999 85。

1.2.2 多酚的提取及含量测定［13］称取5 g豹皮樟粉末，以一定的液固比加入70%乙醇溶液，在一定的功率下超声波提取一定的时间，离心后取上清液，转入到200 mL容量瓶中定容，即为豹皮樟多酚提取液，取适量提取液稀释10倍作为待测溶液。量取1 mL待测溶液，按照标准曲线的绘制方法测定吸光度值，代入回归方程计算得到待测溶液浓度。多酚得率(y)按式(1)计算:

式中:C—待测溶液质量浓度，g/L;V—提取液体积，mL;N—稀释倍数;m—干叶质量，g。

1.2.3 单因素试验 选定提取时间、液固比、超声波功率3个因素进行单因素试验，考察各因素对豹皮樟多酚得率的影响，重复3次测定，取其平均值。

1.2.4 响应面法优化试验 在单因素试验的基础上，为了考察各因素交互作用对豹皮樟多酚得率的影响，运用Design-Expert 7.0软件，根据Box-Behnken的中心组合设计原则，以提取时间、液固比、超声波功率3个因素为自变量，多酚得率为响应值，设计3因素3水平试验，建立响应值与影响因素间的数学模型，得到最佳提取条件并进行验证。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取时间对多酚得率的影响 称取5 g豹皮樟粉末，设定液固比20∶1(mL∶g，下同)，超声波功率300 W，不同提取时间对豹皮樟多酚得率的影响见表1。结果表明:提取时间为20 min时，多酚得率达到最大值，此后随着时间的增加多酚得率下降，这与超声波作用时间过长导致多酚类物质结构被破坏有关，因此，选择提取时间为20 min左右进行进一步优化试验。

2.1.2 液固比对多酚得率的影响 设定提取时间20 min，超声波功率300 W，改变液固比，不同液固比对豹皮樟多酚得率的影响见表1。结果表明:液固比为20∶1时，多酚得率达到最大值，此后随着液固比的增大多酚得率下降，这与溶剂用量过大导致热负荷增大有关，因此，选取液固比为20∶1左右进行进一步优化试验。

表1 不同试验条件对多酚得率的影响Table 1 Effects of different experimental conditions on the polyphenol yield

2.1.3 超声波功率对多酚得率的影响 设定提取时间20 min，液固比为20∶1，改变超声波功率，不同超声波功率对豹皮樟多酚得率的影响见表1。结果表明:超声波功率为300 W时，多酚得率达到最大值，此后随着功率的增大多酚得率下降，这与超声波功率过大导致多酚类物质结构被破坏有关，因此，选择超声波功率为300 W左右进行进一步优化试验。

2.2 响应面法优化试验

2.2.1 响应面试验设计及结果 根据单因素试验结果，以提取时间、液固比、超声波功率3个因素为自变量(X)，多酚得率为响应值(Y)，设计了3因素3水平共17组试验，其中1～12组为析因试验，13～17组为中心试验以分析误差。响应面因素水平设计及试验结果见表2。

对所得数据进行多元回归拟合，方差分析结果见表 3，得到的回归模型为:Y=0.341+0.033 675X1+0.217 2X2+4.857 5 × 10-3X3+5 ×10-4X1X2+1.75 ×10-5X1X3-1.107 5 ×10-3X12-5.33 ×10-3X22-8.575 ×10-6X32。由表3可知，回归模型的P＜0.000 1，影响极显著，失拟项P=0.675 5＞0.05，影响不显著，计算数值与实测数值拟合较好，模型能够用于预测真实的试验数据。在一次项中，提取时间和液固比影响极显著，超声波功率影响不显著;二次项中，3者影响均为极显著;在交互项中，提取时间和液固比交互项影响显著，其它则不显著。各因素对多酚得率影响程度大小顺序为:液固比＞提取时间＞超声波功率。

表2 响应面因素水平设计及试验结果Table 2 Factors and levels of response surface design and the experimental results

表3 回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis of items in regression equation

根据回归方程，绘制响应面图，结果见图1。提取时间和液固比交互项响应面坡度较陡，说明两者交互作用对多酚得率有较大影响。从等高线的疏密度可以看出，液固比对响应值的影响大于提取时间和超声波功率。上述分析与模型回归的方差分析基本一致。

图1 不同反应条件对多酚得率影响的响应面图Fig.1 Response surface for effects of different experimental conditions on the polyphenol yield

2.2.2 最佳条件的预测及验证试验 通过回归模型的预测，得到超声波辅助提取豹皮樟多酚的最佳工艺为:5 g样品，提取时间22.46 min，液固比21.43∶1，超声波功率306.09 W，在此条件下多酚得率可达3.79%。结合实际操作，将各因素调整为:提取时间22 min，液固比21∶1，超声波功率300 W。在此条件下进行3次平行试验进行验证，多酚平均得率为3.76%，与模型预测值的相对误差＜1%，证明由该模型推测得到的最佳工艺参数真实可靠。

3 结论

3.1 采用超声波辅助提取豹皮樟多酚，在单因素试验的基础上，通过响应面Box-Benhnken试验设计，建立了多酚得率的二次多项式数学模型，优化出的最佳工艺条件为:5 g样品，提取时间22 min，液固比21∶1，超声波功率300 W，在此条件下，豹皮樟多酚得率可达3.76%，所优化的工艺参数准确可靠，稳定可行。

3.2 超声波提取法具有操作简便、安全无毒、成本低、提取得率高的优点，容易实现工业化生产。本试验为豹皮樟多酚的进一步研究与开发奠定了基础。

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