吠喃西林及其代谢物氨基脲的检测技术研究

张小军，王 建，严忠雍，龙 举，张 虹

(1.浙江省海洋水产研究所,浙江海洋学院海洋与渔业研究所,浙江舟山 316021; 2.浙江工商大学食品与生物工程学院,浙江杭州 310015）

·综 述·

吠喃西林及其代谢物氨基脲的检测技术研究

张小军1，王 建2，严忠雍1，龙 举1，张 虹2

(1.浙江省海洋水产研究所,浙江海洋学院海洋与渔业研究所,浙江舟山 316021; 2.浙江工商大学食品与生物工程学院,浙江杭州 310015）

呋喃西林（NFZ）作为硝基呋喃的一种,曾经被广泛应用于养殖业,但因其致癌和致畸性现已被世界上多个国家所禁止。由于呋喃西代谢物可与组织结合形成稳定化合物而难以降解,其检测技术也越来越受到重视。本文综述了呋喃西林原药及其代谢物氨基脲（SEM）的检测方法,在阐明各种检测研究方法原理的基础上,从测定结果准确性、检出限和适用范围等方面进行了分析比较,旨在促进呋喃唑酮及其代谢物的检测技术发展。

呋喃西林;氨基脲;检测方法

四种硝基呋喃类药物——呋喃唑酮(Furazolidone,FZD)、呋喃它酮(Furaltadone,FTD)、呋喃妥因(Nitrofurantion,NFT)和呋喃西林(Nitrofurazone,NFZ),曾经被广泛的应用于家畜和家禽的饲养中,用于治疗和预防细菌感染引起的肠道感染疾病[1]。呋喃西林作为硝基呋喃类药物典型代表,因其杀菌能力强、抗菌谱广、不易产生耐药性、价格低廉、疗效好等优点而被广泛的应用于畜禽和水产养殖业。氨基脲(Semicarbazide,SEM),又名氨基甲酰肼,化学分子式为CH5N3O。通常认为氨基脲是养殖常用药物呋喃西林在动物体内的典型代谢物,由于性质稳定,目前欧盟、美国和我国均以SEM作为标示残留物对呋喃西林进行残留检测和监控[2],其结构如图1所示。近年来的研究表明呋喃西林及其代谢物在动物源性食品中的残留可以通过食物链传递给人类,长期摄入会引发多种不良影响:溶血性贫血、多发性神经炎、眼部损害和急性肝坏死等疾病,产生自由氧及其衍生自由基损伤DNA,并且在小鼠口服喂养实验过程出现严重的血管瘤和肺癌等疾病,严重危害人体健康[3-7]。

图1 吠喃西林及其代谢物氨基脲的化学结构Fig.1 Chemical structure of nitrofurazone and itsmetabolite semicarbazide

鉴于硝基呋喃及其代谢物的危害,目前在世界范围内包括美国、日本、欧盟、中国等大部分国家均禁止其用于养殖,并先后制定了相应的残留限量对食品进行严格的残留监控。欧盟将硝基呋喃类药物及其代谢产物列为A类禁用药物,规定在动物源性食品中呋喃类残留物的检出限为不得检出[8];2007年日本厚生劳动省《食品、添加物的规格标准的部分修正件》(2007年厚生劳动省告示第206号)和我国于2002年颁布农业部第193号公告《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》,规定食品中硝基呋喃类药物不得检出;另外,其他国家如澳大利亚(1993),菲律宾(2001),巴西(2002),泰国(2002)以及美国(2002)也进行限定[9-10]。

呋喃西林作为硝基呋喃药物一种,常与其他三种硝基呋喃类药物一同检测。在非动物源性食品中直接进行原药的检测,如常规的动物饲料等。但由于硝基呋喃类药物在动物机体内代谢速度较快,药物半衰期很短,在动物体内能迅速代谢[11],在评估动物源性食品中硝基呋喃类药物残留过程中,只检测其原药显然不够科学,而其代谢物与蛋白结合能产生稳定的残留,常用的食品烹饪方法如蒸煮、煎炸、烘烤和微波加热等均无法使代谢物完全降解[12-13]。因此针对动物源性食品中包括呋喃西林在内的硝基呋喃类药物的检测多是以代谢物残留的检测完成的。

1 基于呋喃西林原约的检测方法

1.1 紫外分光光度法

该方法主要用于对非处方和处方药剂中添加的呋喃西林原药含量的检测,其操作简单,检测方便。欧翠华等[14]选择375 nm作为呋喃西林含量测定波长将此种方法应用于药剂中呋喃西林的检测,结果显示呋喃西林检测浓度的线性范围为1.05～12.6 g/mL,RSD=0.07%。但由于该方法灵敏度较低检出限高,只能达到g/mL数量级，目前较少应用在残留分析领域。

1.2 高效液相色谱方法

液相色谱方法(HPLC)可以建立饲料中呋喃西林以及其他硝基呋喃类药物原药的准确、灵敏的定性定量检测。贾涛[15]利用配备二极管阵列检测器(DAD)和紫外检测器（UV）的高效液相色谱仪对配合饲料和添加剂预混合饲料饲料中硝基呋喃类药物原药残留进行测定。方法用乙腈提取,再经固相萃取柱净化,2%甲酸lmL复容,过滤膜供高效液相色谱测定结果显示该方法可有效测定对配合饲料和添加剂预混合饲料中呋喃西林原药。方法检测限(LOD)和定量限(LOQ)分别为150μg/kg和300μg/kg,平均回收率在90.1%～98.5%,日内变异系数在2.0%～6.0%,日问变异系数在5.2%～8.2%之间。曹鹏等[16]利用DAD检测器进行了饲料中包括呋喃西林在内的硝基呋喃类药物的检测,采用乙腈提取，经正己烷和酸性氧化铝净化，有效简化了前处理方法。流动相采用乙腈-磷酸水溶液可有效分离目标物。方法的LOD和LOQ分别为250μg/ kg、500μg/kg。

HPLC法对呋喃西林原药进行检测,可满足饲料等简单基质的检测,但样品前处理一般较麻烦,LOD和LOQ值都较高,此方法无法满足动物源性食品中SEM的检测。

1.3 流动注射化学发光分析技术

流动注射分析法(flow injection analysis,FI)是指在热力学非平衡条件下,在液流中重现处理试样或试剂区带的定量流动分析技术，化学发光分析法(chemiluminescence analysis,CL)主要是依据化学检测体系中待测物浓度与体系的化学发光强度在一定条件下呈线性定量关系的原理,利用仪器对体系化学发光强度的检测,而确定待测物含量的一种痕量分析方法。将CL与FI相结合而形成的FI-CL分析法大幅度提高检测性能,并且具有分析速度快(0.1～10 s)、精度高、易于实现自动化等特点，这种方法被应用到呋喃西林的检测中。

根据H2O2和NBS(N-bromosuccinimide,溴代丁二酰亚胺)反应产生单态氧,单态氧可以与NFZ化学反应生成具有强烈的CL信号的NFZ衍生物的原理,DU等[17]首次进行了FI-CL方法对呋喃西林检测的方法学验证,成功应用于复合呋喃西林滴鼻液、人血浆和尿液的检测中。方法在0.04mol/LH2O2和0.01mol/ L NBS溶液中以2.1mL/min流速获得最强信号,NFZ检测范围为1.0×10-7～1.0×10-5g/mL,检出限可达到2×10-8g/mL,相对标准偏差小于4%。THONGSRISOMBOON等[18]以高锰酸钾-硫酸(2.5×10-5mol/L)作为发光体系,建立了家禽畜饲料中呋喃西林药物残留的流动注射化学发光分析法,并与HPLC方法进行了验证对比,两种方法具有很好的一致性。该方法检测限可达到0.25mg/L,精密度进一步提高达到1.83%,适用于动物饲料工厂实验室中常规分析。

2 呋喃西林代谢物氨基脲的检测方法

2.1 毛细管色谱分析方法

胶束电动毛细管色谱(micellar electrokinetic capillary Chromatography,MECC)具有很好的分离纯化条件,因其分辨率高、宽泛的可优化操作条件、较短的分析时间、样品与试剂消耗少等优点已被用来进行呋喃西林代谢物的分离和检测。

WICKRAMANAYAKE等[19]利用硝基呋喃和其代谢物有发光团的存在的特性,通过2-NBA衍生化,建立了呋喃西林及其代谢物的胶束电动毛细管色谱检测方法。方法以脱氧胆酸钠（80 mm）为胶束表面活性剂,以20mM硼酸和20mM磷酸为缓冲液,通过中心复合实验设计获得了最佳条件。方法灵敏度呋喃西林LOD可达到1.6μg/mL,SEM可达0.4μg/mL。

2.2 高效液量色谱-质谱联用方法

在NFZ的液相色谱检测中,质谱因其较低检测限和可选择性逐渐替代了UV检测器,应用越来越广泛。自2001年LEITNER等[2]第一次运用液质联用,对于动物食源性样品的NFZ代谢物SEM检测多数都是基于此种方法。作为NFZ的代谢物,SEM在食源性样品中多呈现蛋白结合的形式,这种新式可以稳定存在几周,在微酸条件下,SEM从蛋白上释放在与加入的2-硝基苯甲醛(2-nitrobenzaldehyde,2-NBA)衍生化生成衍生化样品,总SEM含量进行测定。为了提高分析定量的效果,内标加入到样品中,随SEM一起在HCl条件下进行衍生化。最初,4-硝基苯甲醛(4-NBA)作为添加的内标[2],这种内标的缺点是必须在2-NBA衍生化以后加入以防止两者在酸性条件下反应,4-NBA-SEM响应相对较低,在质谱中2-NBA和4-NBA衍生化物质都有m/z 209→192,容易造成模糊或者错误的解析,而氘代内标可以避免这种错误,因此现在应用的内标多为13C15N2-SEM[20-22]或者d4-SEM[23]。在此基础上,一些研究[24-25]将这种方法用于面制品和婴儿制品中SEM的检测,取得了较好效果。

HPLC-MS/MS法作为一种精确、稳定的确证方法使用,因其灵敏快速、分辨率高、重现性好而得到广泛使用,缺点就是成本高,需要配备价格高昂的质谱检测器,不易实现现场快速筛查,很难在基层推广使用。

2.3 酶联免疫吸附分析法

酶联免疫分析法是新开发的一种方法,通过抗体与酶复合物结合,然后通过显色来检测。测量时,抗原先结合在固相载体上,加一种抗体与酶结合成的偶联物(标记物),此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性,当偶联物与固相载体上的抗原反应结合后,再加上酶的相应底物,即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色,其所生成的颜色深浅与欲测的抗原含量成正比。这种方法方便讯速,特异性强并且灵敏度高、特异性好,不需要繁琐的样品前处理,可以在短时间内同时筛选大量的样品。实际运用的过程中可以结合将ELISA方法作为筛选方法,再将HPLC-MS/MS法作为确证性方法联合使用。

GAO等[26]首先制备得到用于检测SEM的单克隆抗体（mAb）。以羧基苯甲醛-SEM(CP-SEM)作为半抗原，经纯化后分别与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联制备免疫原和包被原免疫小鼠,获得了针对CP-SEM的特异性高效抗性蛋白,这种方法对SEM检测线达到0.01μg/L,IC50为1.3μg/kg。COOPER等[27]建立了基于多克隆的抗体酶联免疫检测方法,这种方法快速、简便,并且特异性针对SEM,而对呋喃西林(1.7%)和其他硝基呋喃类药物(＜0.01%)交叉反应率较低。以SEM的衍生物CP-SEM作为半抗原提高多克隆抗体,利用间接ELISA法对鸡肌肉组织中的SEM进行检测,并与LC-MS/MS检测结果对照基本一致,灵敏度为0.25μg/kg,远低于欧盟规定的检出限。VASS等[28]制备了5种CP-SEM的抗体,IC50为0.06～2.28μg/L之间,其中MVK39抗体在间接Elisa上表现高动量范围0.01～0.2μg/L,MVK31在直接Elisa为IC50=0.14μg/L,用这些制备的抗体对婴儿食品进行检测,并以液质联用方法作为比对,结果表现出极大的相关性。

采用ELISA法检测动物组织中SEM具有简单、快速、准确并且不需要特殊实验设备等优点,适合常规实验室检测。目前,国内外用于检测SEM的商品化试剂盒已经上市[29]。

2.4 荧光偏振免疫检测方法

荧光偏振免疫分析技术（FPIA）是一种均相荧光免疫分析法,将其运用到呋喃西林的检测上来,具有操作步骤简单、易于实现自动化控制和现场快速筛查等优点,可满足快速检测的要求。沈玉栋等[30]利用实验室制备的抗体建立了SEM的FPIA方法:通过设计合成新的SEM半抗原2-（4-（2-rarbamoylhydrazono）methyl）phenoxy）acetic acid(CEPSEM),偶联载体蛋白后进行免疫新西兰大白兔,获得亲和力高、特异性好的NPSEM多克隆抗体,最后结合设计合成的2种新荧光示踪物CEPSEM-EDF和CEPSEM-HDF建立了SEM的FPIA方法。结果表明:在示踪物浓度为0.5 nmol/L,抗体稀释度为l/100的优化条件下,检出限为8.3μg/L,线性范围为15.8～145.7μg/L。该方法对于一般非食源性样品的检测已经满足,对于基质复杂的样品则需要进一步研究优化,提高方法灵敏度，以满足食源性样品的分析检测。

2.5 生物传感器技术

JOHN等[31]采用多路复用生物芯片扫描分析对134种不同产地的蜂蜜进行呋喃西林代谢物SEM的筛查检测。此方法前期处理与液质联用检测方法类似,以OasisTMSPE柱进行分离纯化,进行2-NBA衍生化和乙酸乙酯提取,最后用Randox Evidence Investigator分析仪进行分析。这种生物芯片可以准确筛查出硝基呋喃类代谢物,其中SEM为0.9μg/kg,IC50达到2.19μg/kg。结果用HPLC-MS/MS进行确证,这种方法可实现对包括呋喃西林在内的硝基呋喃类代谢物进行快速准确的筛查。

3 总结与展望

本文综述了目前呋喃唑酮及其代谢物的紫外分光光度法、高效液相色谱法、液相色谱-串联质谱法、酶联免疫法、流动注射化学发光分析技术等一系列检测方法。不同方法各具特点,适用于不同的基质和产品。对于NFZ来看,快速检测技术是未来的发展方向;从SEM检测技术发展来看,无需衍生,灵敏度高、准确好的确证技术是未来的研究重点。同时,近年来不断有研究发现在非呋喃西林源的食品中(如虾蟹类、次氯酸处理的食品等)也出现了SEM的检出[32],开发适合不同复杂基质的检测方法,消除假阳性,有效区分自然产生SEM和NFZ代谢产生SEM也是未来检测技术需要解决的一个难点。

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Study on the Determ ination M ethods of Nitrofurazone and Its M etabolite Sem icarbazide

ZHANG Xiao-jun1，WANG Jian2，YAN Zhong-yong1，et al
（1.Zhejiang Marine Fisheries Research Institute，Marine Fisheries Research Institute of Zhejiang Ocean University，Zhoushan 316021；2.School of Food Science and Biotechnology，Zhejiang Gongshang University，Hangzhou 310035，China）

Nitrofurazone（NFZ）as one kind of nitrofuran，was once widely used in farming.Due to its carcinogenicity and teratogenicity，it has been prohibited bymany countries in the world.Determination methods of NFZ are very essential as its metabolite can bind the protein to form steady compound.This paper introduced the determinationmethods of NFZ and itsmetabolite according to a variety of literatures for comparisons of their detection limits，scopes of application and other aspects.iaiming to promote the development of determination technologies of NFZ and itsmetabolite.

nitrofurazone；semicarbazide；determination methods

S859.84

A

1008-830X（2014）05-0442-06

2014-06-20

浙江省自然科学基金项目(LQ13C200004)

张小军(1982-),男,河南洛阳人,博士,研究方向:水产品质量安全及标准化.E-mail：xiaojun3627@163.com