防己生物碱类成分提取纯化工艺研究

杨欣欣，包永睿，王 帅，孟宪生* ，朱瑞卿，朱明香

(1.辽宁中医药大学药学院，辽宁大连 116600;2.辽宁省组分中药工程技术研究中心，辽宁大连 116600;3.辽宁省现代中药研究工程实验室，辽宁大连 116600;4.中国医科大学，辽宁沈阳 110001)

防己为防己科植物粉防己Stephania tetrandra S.Moore的干燥根，性味苦、寒，归膀胱、肺经［1］，为我国常用的中药药材，主产于浙江、广东、广西、安徽、福建等地，具有利水消肿、祛风止痛的功效［2］。防己中的化学成分比较复杂，主要有生物碱、双黄酮类、挥发油、糖类等，现代药理学实验表明生物碱类成分为其主要药效成分。防己生物碱类成分为多种异喹啉生物碱，其中含有量较高的有粉防己碱、防己诺林碱、轮环藤酚碱、二甲基粉防己碱以及小檗胺等，而粉防己碱和防己诺林碱更为其主要活性成分［3］，《中国药典》2010年版也将上述两种成分列为质量控制的主要检测对象。

随着对防己化学成分研究的不断深入，如何将有限的防己资源分离纯化成更多、更纯的有效成分具有广泛的经济和社会效益。防己生物碱类成分的提取、纯化工艺已受到越来越多国内外科研人员的关注，但目前关于防己生物碱类成分的提取、纯化缺乏系统研究［4-9］，本实验对防己中生物碱类成分提取和纯化工艺进行系统研究，为防己药材的合理利用及开发奠定实验基础。

1 材料

1.1 仪器 LS6150型紫外可见光分光光度计 (TENGAO T＆D);Agilent 1100高效液相色谱仪 (二元泵，DAD检测器)，ALC.1C.4电子天平 (SALTORIUS GROUP);HSS型电子恒温水浴锅 (上海博讯实业有限公司医疗设备厂);CP225D十万分之一分析天平 (德国Sartorius)。

1.2 药品与试剂 防己药材购于大连市开发区成大方圆药店，经辽宁中医药大学翟延君教授鉴定为粉防己Stephania tetrandra S.Moore的干燥根;粉防己碱和防己诺林碱对照品 (供含量测定用，购自中国药品生物制品检定所，批号0793-200003、110711-200701);甲醇、冰醋酸 (色谱纯，均购于天津市科密欧化学试剂开发中心);乙腈 (色谱纯，Mtedia公司)，水为去离子水;其它试剂均为分析纯。

2 防己生物碱类成分提取工艺研究

2.1 色谱条件 Agilent-C18色谱柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相为乙腈-甲醇-水-冰醋酸 (40∶30∶30∶1)(每100 mL含十二烷基磺酸钠0.41 g)［10-11］;检测波长280 nm;柱温25℃;体积流量1.0 mL/min。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取粉防己碱和防己诺林碱对照品适量，加甲醇制成防己诺林碱、粉防己碱每1 mL含0.1370 mg、0.1001 mg的对照品溶液。

2.3 单因素水平考察 取防己药材粉末5 g，精密称定，分别选用水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇溶液加热回流提取，每次1 h，提取3次，滤过，合并滤液，3000 r/min离心15 min，将上清液浓缩至药材质量浓度为0.05 g/mL的溶液，测定药材中粉防己碱和防己诺林碱的量，结果见表1。

表1 不同溶剂提取结果

由表1结果可知，70%乙醇提取溶剂中粉防己碱、防己诺林碱的量均高于其他溶剂，故选用70%乙醇作为防己生物碱的最佳提取溶剂。

2.4 提取条件正交设计试验 经相关文献调研和多次预实验，采用L9(34)正交试验的方法确定考察因素为提取时间、溶媒量、提取次数，并选定3个水平，用以粉防己碱和防己诺林碱的量为主指标 (权重系数均为0.4)，干膏收率 (权重系数为0.2)为次指标，即综合指标作为考察指标，优选防己生物碱的最佳提取条件，见表2。

表2 提取条件因素水平

2.5 出膏率试验和粉防己碱、防己诺林碱的测定 精密称取防己药材约5 g(过18目筛)，分别按上述因素水平表进行提取，提取液3000 r/min离心15 min，上清液浓缩成含0.05 g/mL的溶液，用高效液相色谱法进行含量测定。精密吸取上述溶液50 mL，水浴上蒸干 (置已恒重的蒸发皿中)，105℃干燥3 h，冷却至室温，迅速精密称定所得干膏的质量，计算出膏率。

用以药材中粉防己碱和防己诺林碱的量为主指标 (权重系数均为0.4)，干膏收率 (权重系数为0.2)为次指标，即综合指标作为考察指标，优选防己生物碱的最佳提取条件，其结果见表3，方差分析见表4。

表3 提取条件正交试验结果

表4 方差分析

以直观及方差分析对防己生物碱类成分提取实验结果进行评价，结果表明，各因素影响大小顺序是B＞C＞A，各因素中均没有显著差异，因此确定防己生物碱类成分的最佳提取条件为A3B3C2，即8倍量70%乙醇回流提取3次，每次3 h。

2.6 验证试验结果 对最佳提取工艺进行验证试验，结果表明采用优选的提取工艺条件 (A3B3C2)，粉防己碱、防己诺林碱的量以及出膏率均较高，且工艺稳定，结果见表5。

3 防己生物碱类成分纯化工艺研究［12-15］

3.1 树脂的预处理 选取不同极性的8种型号大孔吸附树脂一定量，用95%乙醇浸泡24 h，使其充分溶胀，湿法装柱，用95%乙醇冲洗，洗至流出液与1∶2混合不产生混浊，再用蒸馏水洗，洗至无醇味，备用。

表5 最佳提取工艺验证

3.2 静态吸附试验 准确称取经预处理的HPD-400、HPD-450、 HPD-100、 D101、 AB-8、 NKA-9、 HPD-300、ADS-7树脂各1 g，分别置100 mL锥形瓶中，精密加入最佳工艺样品溶液 (0.4 g/mL)，室温置水平摇床振摇 (90 r/min)24 h至充分吸附，滤过，测定滤液中粉防己碱、防己诺林碱的量，然后用90%乙醇对上述吸附饱和的树脂进行解吸 (操作条件同吸附)，测定解析液中粉防己碱、防己诺林碱的的量，结果见表6。

表6 不同型号树脂的静态吸附量和解析率测定结果

结果表明，各型号树脂的吸附量、解吸率相差较大，综合吸附和解吸两方面的因素，AB-8型大孔树脂的吸附量和解吸率均较高，最终确定AB-8树脂为实验用防己生物碱类成分纯化树脂。

3.3 泄漏曲线考察 取0.2 g/mL的防己提取液缓缓通过已处理好的AB-8大孔吸附树脂柱 (树脂柱床容积约为10 mL，1 BV=10 mL)，体积流量为2 BV/h，收集上样流出液，每份10 mL，测定每份流出液中粉防己碱、防己诺林碱的量，绘制动态吸附曲线，结果见图1。结果表明，流出药液超过60 mL时，即6 BV时，流出液中粉防己碱、防己诺林碱的量显著增大，说明以粉防己碱、防己诺林碱为代表的生物碱类成分出现明显泄漏，确定最大上样量为树脂柱体积的5倍，故确定即树脂与上柱量之比为1 g/mL(药材/湿树脂)。

图1 泄漏曲线考察

3.4 解析液考察 吸取防己最佳工艺样品溶液(0.2 g/mL)，加入已处理好的AB-8大孔吸附树脂柱中，进行动态吸附，以5 BV水洗脱至无色后，再分别用水、10%、30%、50%、70%、90%乙醇各30 mL解析，体积流量2 BV/h，分别收集解析液，每份30 mL，测定不同质量浓度解析液中粉防己碱、防己诺林碱的量，结果见图2。结果表明，90%乙醇对粉防己碱、防己诺林碱的量的解析高于其他浓度的解析液，因此确定90%乙醇为最佳解析液。

3.5 解析液用量考察 吸取防己最佳工艺样品溶液(0.2 g/mL)，加入已处理好的AB-8大孔吸附树脂柱中，用90%乙醇解析，体积流量2 BV/h，每份10 mL，收集解析液，测定粉防己碱、防己诺林碱的量，结果见图3。结果表明，当解析液达到8BV时，已基本将粉防己碱、防己诺林碱洗脱干净，故确定解吸液用量为8 BV。

图2 解析液的考察

图3 解析液用量考察

3.6 验证试验 取防己样品液按上述方法选择的工艺条件进行吸附和洗脱，以粉防己碱、防己诺林碱的量计，总生物碱的纯度可达50%。

4 结论与讨论

4.1 防己生物碱类成分最佳提取工艺为8倍量70%的乙醇回流提取3次，每次3 h;最佳纯化工艺为选用AB-8型号树脂，3倍柱体积水除杂，8倍量90%乙醇，药材树脂用量比1∶1(g/mL)，以粉防己碱、防己诺林碱量计，纯化后纯度约为50%。

4.2 实验中所用大孔吸附树脂可以重复使用，成本低;大孔吸附树脂操作简便，溶剂消耗也不大，避免了使用大量有机溶剂进行萃取的步骤，同时也减少了有机溶剂对人体的毒害。大孔吸附树脂因其操作简单.快速、高效、低毒的良好性质，使其在中草药化学成分的提取分离研究中的应用越来越广泛。现在已有不同类型的大孔吸附树脂，适用于分离不同性质的化合物。

4.3 本实验以粉防己碱、防己诺林碱作为定量检测指标，优选最佳纯化工艺与与前期采用紫外分光光度法以总生物碱量作为定量检测指标实验结果一致，实验结果提示该方法准确可靠，可以作为防己生物碱类成分的检测指标。

4.4 本实验确定了中药防己的最佳提取和纯化工艺，方法操作简单，适合实际生产，为防己药材的合理利用及开发奠定实验基础。

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