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干姜、炮姜中成分的比较

2014-11-04张科卫马彩霞缪六舒

中成药 2014年6期
关键词:干姜产地生姜

张科卫,马彩霞,缪六舒

(南京中医药大学,江苏南京 210023)

干姜为姜科植物姜 Zingiber Offtcinale Rosc.的干燥根茎,味辛,性热,归脾、胃、肾、心、肺经。具有温中散寒,回阳通脉,温肺化饮之功。用于腕腹冷痛,呕吐泄泻,肢冷脉微,寒饮喘咳等症。

炮姜是干姜经砂烫法制得的炮制加工品,味辛,性热,归脾、胃、肾经。具有温经止血,温中止痛之功。用于阳虚失血,吐衄崩漏,脾胃虚寒,腹痛吐泻等症[1]。

干姜、炮姜均为生姜的加工炮制品,而两者主治功效差异甚大,这必与其炮制前后的成分改变有很大关系。查阅文献,目前对干姜、炮姜中总的成分的比较研究鲜见报道。

多糖类物质在中药中广泛存在,具有降血糖、降血脂、免疫调节、抗氧化、抗肿瘤等多种生物活性[2-7]。有研究表明,生姜中所含的多糖类物质有很好的抗氧化活性[8]。

姜酚类物质是目前生姜中发现的另一大类有效物质。药理学方面的实验研究证实,姜酚类物质具有抗氧化[9]、抗肿瘤[10]、抗神经损伤和细胞保护[11]、抗呕吐[12]等多种生理活性。

近年来的研究还表明,生姜中富含黄酮类成分,且该类成分具有抗氧化[13-15]、抑菌[16]等生理活性。

干姜、炮姜为生姜的炮制加工品,生姜经过一定的炮制,其中的多糖、总酚、黄酮类物质是否发生了改变,目前尚未见到相关文献的报道。

对干姜、炮姜中几种姜酚类成分的测定虽有相关报道,但是所取样本地域范围较小,不足以体现我国幅员辽阔,及生姜出口大国的地位。

本实验对来自全国多个产地的干姜、炮姜中所含的多糖类、总酚类、总黄酮类成分及几种姜酚类物质进行了定量测定及比较研究,以期为进一步研究生姜的炮制机理进行一定的探索。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津UV-2401紫外可见分光光度计;Sartorius BP211D型电子天平;TCG-16G台式离心机 (上海安亭科学仪器厂)。Waters e2695型高效液相色谱仪,2998PDA检测器,Millennium32色谱管理系统;Sartorius BP211D型电子天平。

1.2 试药 葡萄糖 (批号110833200503)、没食子酸 (批号110831-200803);芦丁 (批号080-9303)对照品均购自中国药品生物制品检定所(供含量测定用);6-gingerol(批号111228)、8-gingerol(批号120302)、10-gingerol(批号120316)、6-shogaol(批号110516)对照品均购自四川维克奇生物科技有限公司,经HPLC检测为单一成分,纯度达到98%以上。

乙腈、甲醇为色谱纯;水为亚沸蒸馏水 (自制);其他试剂均为国产分析纯。

生姜药材产地分别为海南海口、湖北武汉、山东滕州、山东郯城、福建永春、湖南永州、江西上饶、安徽浍沟、四川西昌、江苏邹庄。以上生姜均为2012年3月收集得到。

1.3 干姜的制备 取上述各产地的生姜,洗净,切片,50℃ 干燥;打粉,过4号筛,即得。

1.4 炮姜的制备 将上述各产地的生姜 (与制备干姜的生姜为同一批次),洗净,切片,50℃ 干燥,得干姜饮片;将此干姜饮片按砂烫法烫至鼓起,表面棕褐色时,取出,放凉;打粉,过4号筛,即得。

2 方法与结果

2.1 多糖测定 参照本课题组百合多糖测定方法[17],结果见表 1。

2.2 总酚测定 参照本课题组生姜中总酚测定的方法[18],结果见表 2。

表1 不同产地干姜、炮姜中所含多糖的量 (n=6)Tab.1 Contents of polysaccharide in dried ginger(ganjiang)and processed ginger(paojiang)from different habitats(n=6)

表2 不同产地的干姜、炮姜中所含总酚的量 (n=6)Tab.2 Contents of total phenols in dried ginger(ganjiang)and processed ginger(paojiang)from different habitats(n=6)

2.3 黄酮测定

2.3.1 试剂的配制

2.3.1.1 对照品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的芦丁对照品适量,加60%乙醇,配制成0.2090 mg/mL的对照品贮备液。

2.3.1.2 干姜供试品溶液的制备 精密称取干姜细粉1.0 g,加60% 乙醇20 mL,超声 (工作频率80 kHz,功率 250 W)30 min,离心 (4900 r/min)5 min,取上清液置50 mL量瓶中,残渣加60% 乙醇洗涤2次,每次5 mL,同前离心,合并上清液,加60% 乙醇定容,摇匀。

2.3.1.3 炮姜供试品溶液的制备 精密称取炮姜细粉1.0 g,同“干姜供试品溶液的制备”项下操作。即得。

2.3.2 测定波长的选择 精密吸取对照品溶液、干姜供试品溶液、炮姜供试品溶液各0.5、0.5、0.2 mL,分别置于10 mL的棕色具塞试管中,分别加入60% 乙醇0.5、0.5、0.8 mL,摇匀,分别依次加入甲醇1 mL,10%AlCl3溶液0.1 mL和0.1 mL醋酸钾溶液,蒸馏水2.8 mL,60% 乙醇5.0 mL,摇匀,室温放置 30 min,于 200~400 nm范围内进行光谱扫描,结果表明,对照品溶液和供试品溶液的最大吸收波长均为270 nm(见图1)。

图1 对照品 (芦丁)及样品 (江苏邹庄干姜黄酮、江苏邹庄炮姜黄酮)的紫外光谱图Fig.1 UV Spectrum of reference substance(rutin)and samples(general flavones in dried ginger(ganjiang)and processed ginger(paojiang)from Zouzhuang of Jiangsu province)

2.3.3 标准曲线的绘制 精密吸取对照品贮备液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于10 mL具塞试管中,分别加 60% 乙醇 1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.0 mL,加入 1.0 mL甲醇,10%AlCl3溶液0.1 mL和0.1 mL醋酸钾溶液,蒸馏水2.8 mL,60% 乙醇 5.0 mL,摇匀,室温放置 30 min,在270 nm测定吸光度。以吸光度为纵坐标,进样质量浓度为横坐标绘制标准曲线,求得回归方程为Y=0.0398X-0.0203,r=0.9999。线性范围为4.18 ~20.90 μg/mL。

2.3.4 精密度试验 取0.01254 mg/mL的对照品溶液,重复测定6次,记录其吸光度的值,RSD为0.45%,结果表明仪器精密度良好。

2.3.5 稳定性试验

2.3.5.1 干姜黄酮稳定性试验 精密吸取新鲜配制的干姜供试品 (江苏邹庄产)溶液0.5 mL置于10 mL的棕色具塞试管中,照“2.3.2”项下操作,分别于0、0.5、1、1.5、2 h测定其在270 nm处的吸光度,结果RSD为0.76%,结果表明本法所测样品在2 h内保持稳定。

2.3.5.2 炮姜黄酮稳定性试验 精密吸取新鲜配制的炮姜供试品 (江苏邹庄产)溶液0.2 mL,加60% 乙醇0.8 mL,置于10 mL的棕色具塞试管中,照“2.3.2”项下操作,分别于 0、0.5、1、1.5、2 h测定其在270 nm处的吸光度,结果RSD为0.88%。表明本法所测的干姜、炮姜样品溶液在2 h内保持稳定。

2.3.6 重复性试验 分别精密称取产自江苏邹庄并经低温干燥至恒重的干姜、炮姜细粉约1.0 g,平行6份。分别制成供试品溶液,照“2.3.2”项下操作,结果其中干姜所含黄酮的平均含有量为1.09%,RSD为0.99%;炮姜所含黄酮的平均含有量为2.71%,RSD为1.20%。表明所测样品的重复性良好。

2.3.7 加样回收率试验

2.3.7.1 干姜加样回收率试验 取芦丁对照品适量,加60%乙醇溶解,配成质量浓度为0.5642 mg/mL的溶液,作为加样对照品贮备液。取产自江苏邹庄并经低温干燥至恒重的干姜细粉,精密称取该细粉约0.5 g,平行6份,精密加入加样对照品贮备液 10.0 mL,加 60% 乙醇 10 mL,照“2.3.1.2”及“2.3.2”项下操作,于 270 nm处测定吸光度的值并计算回收率,得平均回收率为100.02%,RSD为1.57%。

2.3.7.2 炮姜加样回收率试验 取芦丁对照品适量,加 60% 乙醇溶解,配成质量浓度为1.3645 mg/mL的溶液,作为加样对照品贮备液。取产自江苏邹庄并经低温干燥至恒重的炮姜细粉,精密称取该细粉约0.5 g,平行6份,精密加入加样对照品贮备液 10.0 mL,加 60% 乙醇 10 mL,照“2.3.1.2”及“2.3.2”项下操作,于270 nm处测定吸光度的值并计算回收率,得平均回收率为99.46%,RSD为1.02%。

2.3.8 样品测定 取各产地的干姜、炮姜细粉,各精密称取约1.0 g,每个产地平行3份,按供试品溶液制备方法制备,照“2.3.2”项下操作,测定其270 nm处的吸光度,每份平行测定2次。根据标准曲线计算其中黄酮的量。结果见表3。

表3 不同产地的干姜、炮姜中所含黄酮的量 (n=6)Tab.3 Contents of general flavones in dried ginger(ganjiang)and processed ginger(paojiang)from different habitats(n=6)

2.4 几种活性成分的测定

2.4.1 色谱条件 Agilent TC-C18(2)(4.6 mm×250 mm,5 μm);流动相为乙腈 (A)-水 (B),梯度洗脱 (0~15 min,15% ~50%A;15~45 min,50%A;45~65 min,50% ~80%A;65~67 min,80% ~100% A;67 ~69min,100%~15%A;再保持13 min至82 min);体积流量1.0 mL/min;柱温30℃;检测波长280 nm。理论塔板数以6-gingero计不低于4000,并且6-gingerol、8-gingerol、10-gingerol、6-shogaol 与其他相邻组分的分离度均大于1.5。见图2。

2.4.2 溶液的制备

2.4.2.1 对照品溶液的制备 取减压干燥至恒重的 6-gingerol、8-gingerol、10-gingerol、6-shogaol 适量,精密称定,配制含6-gingerol 3002 μg/mL、8-gingerol 376 μg/mL、6-shogaol 74 μg/mL、10-gingerol 452 μg/mL的混合对照品溶液,作为混合对照品贮备液。

2.4.2.2 供试品溶液的制备 精密称取各产地干姜、炮姜各1.0 g,加30 mL甲醇,超声 (工作频率80 kHz,功率250 W)30 min,4900 r/min离心10 min,取上清液置50 mL量瓶中,残渣加甲醇洗涤两次,每次5 mL,同前离心,合并上清液,加甲醇定容,摇匀。即得。

2.4.3 线性关系的考察 精密称取该贮备液0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mL置于10 mL量瓶中,加甲醇溶解定容至刻度,摇匀,制得混合对照品溶液系列Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ。取 10 μL进样,测定,以对照品质量浓度对峰面积平均值作图,结果经回归分析,6-gingerol在30.02~480.32 μg/mL范围内有良好的线性关系,回归方程为Y=5582.2X-39667,r= 0.999 9;8-gingerol在 3.76 ~60.16 μg/mL范围内有良好的线性关系,回归方程为 Y=5764.4X-1452.8,r=0.9999;6-shogaol在0.74~11.84 μg/mL范围内有良好的线性关系,回归方程为 Y=14856X+1590.4,r=0.9998;10-gingerol在4.52~72.32 μg/mL范围内有良好的线性关系,回归方程为 Y=5837.7X-7859.6,r=0.9998。

2.4.4 精密度试验

2.4.4.1 对照品精密度试验 精密吸取混合对照品溶液Ⅲ10 μL进样,重复6次,以峰面积计算RSD,结 果 6-gingerol、8-gingerol、6-shogaol、10-gingerol的RSD分别为1.83%、1.19%、1.55%、0.53%。

2.4.4.2 干姜精密度试验 取干姜供试品溶液(海南海口)重复进样6次,进样量10 μL,记录所测各组分积分面积。结果6-gingerol、8-gingerol、6-shogaol、10-gingerol的 RSD分别为 1.71%、1.40%、1.67%、1.86%。

图2 对照品及样品的HPLC图谱Fig.2 HPLC chromatogroms of reference substance and samples

2.4.4.3 炮姜精密度试验 取炮姜供试品溶液(海南海口)重复进样6次,进样量10 μL,记录所测各组分积分面积。结果6-gingerol、8-gingerol、6-shogaol、10-gingerol的 RSD分别为 0.89%、0.50%、0.87%、1.09%。

控制预测[6]系统是超导磁场储能型微网预测控制模型的核心部分,并且是最复杂与关键的板块,能够划分为两个板块:外环控制和内环控制。

2.4.5 重复性试验

2.4.5.1 干姜 取同一批次海南海口干姜,按供试品溶液的制备方法平行制备6份,依法测定,计算各组分的量,结果 6-gingerol、8-gingerol、6-shogaol、10-gingerol的 RSD分别为0.82%、1.41%、0.92%、1.96%。

2.4.5.2 炮姜 取同一批次海南海口炮姜,按供试品溶液的制备方法平行制备6份,依法测定,计算各组分的量,结果 6-gingerol、8-gingerol、6-shogaol、10-gingerol的 RSD分别为1.88%、1.07%、1.76%、1.85%。

2.4.6 稳定性试验

2.4.6.1 干姜 新配制的干姜供试品溶液 (海南海口产),分别于 0、1.5、3.0、4.5、6.0、7.5、9.0、10.5、12 h进样 9次,测定 6-gingerol、8-gingerol、6-shogaol、10-gingerol峰面积,结果其RSD分别为 1.81%、1.09%、1.56%、1.53%,表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.4.6.2 炮姜 新配制的炮姜供试品溶液 (海南海口产),分别于 0、1.5、3.0、4.5、6.0、7.5、9.0、10.5、12 h进样 9次,测定 6-gingerol、8-gingerol、6-shogaol、10-gingerol峰面积,结果其RSD分别为 1.46%、1.49%、1.73%、1.79%,表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.4.7 加样回收率试验

2.4.7.1 干姜 分别精密称取6-gingerol、8-gingerol、6-shogaol、10-gingerol各适量,配制成含 6-gingerol 673.12 μg/mL、8-gingerol 99.92 μg/mL、6-shogaol 5.06 μg/mL、10-gingerol 179.96 μg/mL的混合溶液,即为加样对照品贮备液。

精密称取干姜 (海南海口产)0.5 g,平行6份,精密加入上述加样对照品贮备液5.0 mL,照供试品溶液制备项下操作。结果,6-gingerol、8-gingerol、6-shogaol、10-gingerol的加样回收率分别为 99.93%、99.69%、99.78%、99.87%,RSD分别为1.55%、1.61%、1.27%、1.74%。

2.4.7.2 炮姜 分别精密称取6-gingerol、8-gingerol、6-shogaol、10-gingerol各适量,配制成含 6-gingerol 419.6 μg/mL、8-gingerol 70.4 μg/mL、6-shogaol 55.6 μg/mL、10-gingerol 145.6 μg/mL 的混合溶液,即为加样对照品贮备液。

精密称取炮姜 (海南海口产)0.5 g,平行6份,精密加入上述加样对照品贮备液5.0 mL,照供试品溶液制备项下操作。结果,6-gingerol、8-gingerol、6-shogaol、10-gingerol的加样回收率分别为 99.81%、99.03%、99.27%、99.45%,RSD分别为1.56%、1.33%、1.56%、1.54%。

2.4.8 样品测定 取各产地的干姜、炮姜,照“2.4.2.2”项下操作,制成供试品溶液,取10 μL进样,以外标法计算,每个产区的干姜、炮姜平行3份,每份进样2次。结果见表4。

3 结论与讨论

3.1 实验结果表明,来自全国各产地的干姜与炮姜中多糖、总酚、黄酮及几种活性成分的量差异显著,同批次生姜炮制品中,炮姜中所含有的多糖、总酚、黄酮的量明显高于干姜;而对几种活性成分的量测定结果表明,炮姜中所含的6-gingerol、8-gingerol、10-gingerol的量明显低于干姜,而 6-shogaol的量明显高于干姜,这可能与在砂炒过程中,由于受高温的影响,饮片中的相关成分发生了变化有关。

表4 不同产地的干姜、炮姜中几种姜酚类成分的量 (n=6)Tab.4 Contents of several gingerols and 6-shogaol in dried ginger(ganjiang)and processed ginger(paojiang)from different habitats(n=6)

3.2 干姜中含多糖量最高的为福建永春,13.99%;含多糖量最低的为山东滕州,3.23%。十个产地的干姜中多糖平均含有量为7.01%。炮姜中含多糖量最高的为海南海口,17.88%;含多糖量最低的为山东郯城,7.87%。十个产地的炮姜中多糖平均含量为11.90%。

3.3 在实验过程中,本课题组还测定了干姜和炮姜中的总糖量、非多糖量,结果表明,干姜和炮姜中所含有的总糖量基本一致,非多糖量与多糖量呈现明显的负相关。说明在炮制过程中,由于受高温的影响,多糖量升高,非多糖量下降。至于在炮制过程中,这些多糖和非多糖的结构到底如何改变,以及这些改变是否与干姜、炮姜的功效有直接的关系,值得进一步深入研究。

3.4 干姜中含总酚量最高的为安徽浍沟,1.85%,含总酚量最低的为海南海口,1.23%,十个产地的干姜中总酚平均含有量为1.53%。炮姜中含总酚量最高的为湖北武汉,2.86%,最低为福建永春,1.68%。十个产地的炮姜中含总酚的平均含有量为2.09%。

3.5 干姜中含黄酮量最高的为江西上饶,1.32%,含黄酮量最低的为海南海口,0.94%,十个产地的干姜中黄酮平均含量为1.12%。炮姜中含黄酮量最高的为山东郯城,4.14%,含黄酮量最低的为福建永春,1.86%,十个产地的炮姜中黄酮的平均含量为2.86%。

3.6 在《中国药典》2010年版中,干姜和炮姜的含量测定项下仅测定了6-姜辣素 (即6-gingerol),这个方法对控制其质量不是很全面,也不科学。本实验对其中的多种姜酚类成分进行了测定,同时还对其中的多糖、总酚、黄酮类物质也进行了定量测定研究。以期为控制干姜和炮姜的质量做一些有益的探索。

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