乌兰十三味汤散显微鉴别及其中苦参碱、氧化苦参碱和栀子苷的测定

包桂花，其乐格尔，包同力嘎

(内蒙古民族大学，内蒙古通辽 028300)

蒙药乌兰十三味汤散载自《观者之喜》第五章收录之“乌兰-13(别名为玛日钦朱素木或白脉红汤)”［1］，之后《蒙药验方》及《中国医学百科全书·蒙医学》均有记载［2-3］。1984年载入《内蒙古蒙成药标准》，方名为 “伊赫-乌兰-13汤”［4］。1998年升入国家标准，收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》(蒙药分册)，方名改为乌兰十三味汤散或乌兰-13［5］。由苦参、土木香、悬钩子木、山柰、诃子、栀子、川楝子等十三味药材组成，具有清血热功效。用于血热上盛，头痛，目赤，高血压症。由于苦参碱和氧化苦参碱具有镇痛、解热、降温和降血压之功效［6］;栀子苷多用于解热镇痛、抗炎等症［7］，其上述指标的功效正与该制剂的药效相吻合，故选择以上指标成分进行测定，为该药的进一步研究提供依据。

1 仪器与材料

LC-20AT和LC-10ATvp泵 (日本岛津)，SPDM20A、CBM-20A、SPO-10Avp检测器 (日本岛津)，LCsolution和N3000色谱工作站;ADW220D型电子分析天平(日本岛津);KQ-100超声波清洗器 (昆山);MODEL ECLIPSE E200彩色生物显微图像分析系统 (尼康);苦参碱 (批号110805-200508)、氧化苦参碱 (批号110780-20100)和栀子苷 (批号110749-200613)购自中国药品生物制品检定所，纯度均＞98%;蒙药乌兰十三味汤散由阜新蒙药有限责任公司 (简称阜新蒙药，批号20121201)、内蒙古奥特奇蒙药股份有限公司 (简称奥特奇蒙药，批号120821)、内蒙古库伦蒙药股份有限公司 (简称库伦蒙药，批号121115)提供;乙腈和甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 苦参碱和氧化苦参碱的测定

2.1.1 色谱条件 Inersii-NH2柱(250 mm×4.6mm，5 μm)，体积流量1.0 mL/min，流动相为乙腈-无水乙醇-3%磷酸溶液 (80∶10∶10)，柱温25 ℃，检测波长 220 nm，进样量 10 μL［8-10］。

2.1.2 混合对照品溶液配制 精密称取苦参碱4.98 mg、氧化苦参碱6.03 mg，各置10 mL量瓶中，加乙腈-无水乙醇 (80∶20)使溶解并稀释至刻度，摇匀，分别作为对照品贮备液。精密量取以上贮备液各0.5 mL，置10 mL量瓶中加乙腈-无水乙醇制成每1 mL含苦参碱25 μg、氧化苦参碱30 μg的混合溶液。即得。

2.1.3 供试品溶液制备 取样品 (批号121115)约2.0 g，精密加入0.5 mL浓氨试液和20 mL三氯甲烷，密塞，称定质量，超声处理30 min(功率250 W，频率33 kHZ)，放冷，再称定质量，用三氯甲烷补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液10 mL，置中性氧化铝柱 (内径2 cm，100～200目，10 g，)上，分别用20 mL三氯甲烷、三氯甲烷-甲醇 (7∶3)洗脱，收集洗脱液并浓缩至干，残渣加无水乙醇溶解，置10 mL量瓶中后稀释至刻度，即得。按处方量制备不含苦参阴性样品，依照该方法制备阴性样品溶液，在此条件下的色谱图见图1。

2.1.4 线性关系考察 精密吸取“2.1.2”项下的对照品，取2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积值。以苦参碱和氧化苦参碱为横坐标，以苦参碱 (YC)和氧化苦参碱 (YD)的色谱峰峰面积比为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。YC=49671x－2319.7(r=0.9997)，YD=87028x －7019.8(r=0.9998)。结果苦参碱在0.05～0.35 μg、氧化苦参碱在0.06～0.42 μg范围内线性关系良好。

2.1.5 精密度试验 精密吸取“2.1.3”项下的供试品10 μL，在“2.1.1”项色谱条件下进样6次，结果峰面积的RSD为苦参碱0.53%、氧化苦参碱1.49%，说明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 取本品 (批号121115)供试品溶液10 μL，分别于0、2、4、6、8、10 h进样，结果峰面积的RSD为苦参碱0.68%、氧化苦参碱1.71%，故供试品溶液10h稳定性好。

图1 HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms

2.1.7 重复性试验 取本品 (批号121115)约2.0 g，按“2.1.3”项下的方法分别制备6份供试品溶液，依照“2.1.1”项测定，故峰面积的RSD为苦参碱1.34%、氧化苦参碱1.26%，说明此法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验 取已知含有量的样品(批号121115)约1.0g，精密加入“2.1.2”项下的对照品贮备液0.6 mL和0.45 mL，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，依法测定并计算回收率，结果见表1。

2.1.9 样品测定 取样品 (批号121115、20121201、120821)约 2.0 g，按 “2.1.3”项下的方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项拟定条件下测定，结果见表2。

2.2 栀子苷测定

2.2.1 色谱条件 Diamonsil C18柱 (5 μm，4.6 mm×250 mm)，体积流量1.0 mL/min，流动相为甲醇-0.1%磷酸溶液 (25∶75)，柱温25℃，检测波长 238 nm，进样量 10 μL［9-10］。

表1 乌兰十三味汤散的回收率Tab.1 Results of recovery tests for Wulan Thirteen Herbs’Powder

表2 不同厂家产乌兰十三味汤散的测定结果Tab.2 Determination results of Wulan Thirteen Herbs’Powder from different manufacturers

2.2.2 对照品溶液配制 精密称取栀子苷4.3 mg，加甲醇制成43 μg/mL的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液制备 取样品0.7 g，加入50%甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声20 min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，取续滤液10 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。按处方量制备不含栀子阴性样品，依照该方法制备阴性样品溶液，在此条件下的色谱图见图2。

2.2.4 考察线性关系 精密吸取“2.2.2”项下的对照品2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 μL注入液相色谱仪，测定峰面积值。以栀子苷进样量为横坐标，栀子苷 (YD)的色谱峰峰面积比为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。YD=39182x+5908(r=0.9999)。结果栀子苷在0.1075～0.5375 μg范围内线性关系良好。

图2 HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatograms

2.2.5 精密度试验 精密吸取“2.2.3”项下的供试品10 μL，在“2.2.1”项色谱条件下进样6次，结果峰面积的RSD为0.98%。说明仪器精密度良好。

2.2.6 稳定性试验 取本品 (批号121115)供试品溶液 10 μL，分别于 0、2、4、6、8、10、12 h进样，结果峰面积的RSD为1.06%。表明12 h测定结果稳定。

2.2.7 重复性试验 取本品 (批号121115)约0.7 g，按“2.2.3”项下的方法分别制备6份供试品溶液，依照“2.2.1”方法测定，峰面积的RSD为1.38%，该方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验 取已知含有量的样品 (批号121115)约0.35 g，精密称定，加“2.2.2”项下对照品贮备液2 mL，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，依法测定并计算回收率，结果见表1。

2.2.9 样品测定 取样品 (批号121115、20121201、120821)约 0.7 g，按 “2.2.3”项下的方法制备供试品溶液，在“2.2.1”项拟定条件下测定。结果见表2。

2.3 显微鉴别 取样品粉末，在显微镜下观察，晶纤维，多呈束，纤维细长，直径11～27 μm，壁甚厚，非木化，孔沟不明显，胞腔线形，草酸钙方晶呈类双锥形，菱形或多面性 (苦参);木化细胞，较多，成片，淡黄色，呈类方形、类多角形、类三角形、长方形或不规则形，边缘有突起或短分支，或一端扩大如靴形，直径22～54 μm，扩大部分可至136 μm，壁厚2～6 μm，木化，孔沟密集，圆点状，斜裂缝状或人字状 (诃子);内果皮石细胞，无色或黄色，常上下层交错排列或纤维连接。呈类长方形、类圆形或类三角形，直径14～34 μm，胞腔内常含草酸钙方晶，有的并含砂晶 (栀子);果皮晶纤维，淡黄色，呈束，常上下层交错排列或排列不整齐，纤维长短不一，稍弯曲，末端钝圆，直径9～36 μm，含晶细胞壁厚薄不一，木化 (川楝子);非腺毛大型，单细胞，多弯曲成人字形，顶端鈍圆，基部狭窄，完整者长至1260 μm，中部直径86 μm，壁厚2～7 μm，微木化，较粗者壁有网状纹理 (枇杷叶);菊糖众多，无色，呈不规碎块状(土木香);花粉粒深黄色，散在，类圆形，直径16～20 μm，外壁厚约至2 μm，光切面观外壁光滑(金莲花)，结果见图 3［11-13］。

图3 乌兰十三叶汤散显微特征图 (10×10)Fig.3 Wulan Thirteen Herbs’Powder microscopic characteristic figures(10×10)

3 讨论

3.1 采用HPLC法测定乌兰十三味汤散中苦参碱和氧化苦参碱的量，选取甲醇-无水乙醇-3%磷酸溶液 (80∶10∶10)为流动相时阴性对照样品有干扰;以乙腈-无水乙醇-3%磷酸溶液 (80∶10∶10)为流动相时阴性对照样品无干扰且分离度大于1.5，但样品和对照品被测组分的保留时间稍有变化，经加标试验，证实样品中的分别是苦参碱和氧化苦参碱。

3.2 在上述色谱条件下，理论板数按苦参碱峰和栀子苷的峰计算分别高于2000和1500。

3.3 目前该制剂无质量控制方法，本实验采用HPLC法测定苦参碱、氧化苦参碱、栀子苷的量，该方法简便，重复性好，为制定乌兰十三味汤散的质量标准提供依据。

3.4 显微鉴别时，每批最少做3张，在显微镜下每张片观察3～6个视野，观察每个视野时应自上左至下右逐渐转动粉末片，并全面地观察，将观察到的有关特征与单味药的显微特征进行对照，将显著并重复性好的苦参、诃子、栀子、川楝子、枇杷叶、土木香、金莲花等的显微特征用于该品的鉴别特征。

［1］晋木旦森嘉措.观者之喜［M］.赤峰:内蒙古科技出版社，1977:174.

［2］内蒙古自治区医院.蒙药验方［M］.呼和浩特:内蒙古新华印刷厂，1971:197-198.

［3］白清云.中国医学百科全书·蒙医学［M］.上海:上海科技出版社，1992:723.

［4］内蒙古自治区卫生厅.内蒙古蒙成药标准［S］.赤峰:内蒙古科学技术出版社，1984:274.

［5］中华人民共和国卫生部.中华人民共和国卫生部药品标准:蒙药分册［S］.北京:1998:73.

［6］张凤玲，唐 永，张景梅.苦参碱、氧化苦参碱的药理作用及其制剂的研究进展［J］.河南中医学院学报，2004，112(3):84-86

［7］郭曙军，赵志英.栀子苷的药理作用及其作用机制研究进展［J］.包头医学院学报，2013，29(2):111-113.

［8］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:188，231，附录18.

［9］叶世芸，卢顺林，毕嘉乐，等.HPLC测定妇炎膜中苦参碱及氧化苦参碱的含量［J］.现代中药研究与实践，2012，26(5):55-59.

［10］陈大中，赵润琴.高效液相色谱法测定艾愈片中苦参碱和氧化苦参碱的含量［J］.中国实验方剂学杂志，2008，14(3):20-21.

［11］韩 杰.HPLC测定清开灵颗粒中黄芩苷、栀子苷及胆酸、猪去氧胆酸的含量［J］.中成药，2010，32(2):227-231.

［12］朱 琦，吴炳忠，沈晓霞.产地和采收时间对栀子中栀子苷含量的影响［J］.中国现代中药，2012，14(7):18-20.

［13］张贵君.常用中药鉴定大全［M］.哈尔滨:黑龙江科学技术出版社，1993.