pH对衰老相关β-半乳糖苷酶染色的影响

陈 亮， 毕 波， 曾继平， 杨清建， 周轶群， 杨 平， 郭 妤， 朱晶晶， 刘天一

实验研究

pH对衰老相关β-半乳糖苷酶染色的影响

陈 亮， 毕 波， 曾继平， 杨清建， 周轶群， 杨 平， 郭 妤， 朱晶晶， 刘天一

目的观察正常老化及应激诱导老化(stress-induced premature senescence, SIPS)的小鼠成纤维细胞在不同pH值条件下，衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase，SA-β-Gal)染色效果的变化规律。方法取新生1～3 d C57BL/6小鼠背部皮肤成纤维细胞进行传代培养，UVB照射应激诱导老化细胞，以不同代次的细胞和应激诱导老化细胞为实验对象，进行衰老相关蛋白检测，并在不同pH条件下进行衰老相关β-半乳糖苷酶染色，对其着色情况进行观察和分析。结果在P1代细胞、P6代细胞、应激诱导老化细胞和P12代细胞中，p53/p21蛋白表达依次增多；正常P1代细胞衰老相关β-半乳糖苷酶染色阴性，其余细胞组随着pH值的由低到高(6.0～8.0)，着色情况均呈现由强到弱的变化趋势，P6细胞、SIPS细胞、P12细胞分别在pH 7.0、7.5和8.0时阳性染色消失。结论随着细胞衰老程度的增加，衰老相关β-半乳糖苷酶染色将在较高pH时才会呈现假阴性，提示染色时安全pH范围应根据细胞代次而定。

细胞衰老; pH; 衰老相关β-半乳糖苷酶染色

人口老龄化是当前世界各国面临的一个难题。细胞衰老作为生物衰老的基本单位，在抗衰老相关研究中的地位也与日俱增，细胞衰老的有效评估指标也变得越来越重要[1-2]。1995年，由Gp Dimri等首次提出的衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase, SA-β-Gal)，作为一种鉴别衰老细胞的有效指标已被广泛应用。在pH值为6.0时，SA-β-Gal可特异性识别体内外的衰老细胞，并且染色的阳性率随衰老程度的增加而升高。后续研究表明，SA-β-Gal与衰老细胞内溶酶体的增多有关。降低pH值会增加非特异性着色，pH为4.5时所有细胞均着色[3]；但碱性条件下，SA-β-Gal特异性如何变化却并不十分清楚。自2014年3月，笔者研究以C57BL/6小鼠不同代次的细胞和应激诱导老化(stress-induced premature senescence, SIPS)细胞为实验对象，观察碱性条件下SA-β-Gal染色效果的变化规律，为正确SA-β-Gal染色提供参考。

1 材料与方法

1.1 小鼠皮肤成纤维细胞的获取 取1～3 d SPF级C57 BL/6小鼠1只，乙醚麻醉处死后，浸泡于75%乙醇中约10 min，用DMEM洗去残留乙醇，置于培养皿中，分离背部皮肤，剪下皮肤组织块约1 cm×1 cm，立即置于2%中性蛋白酶中，37 ℃恒温消化4 h；将皮肤取出，镊子分离表皮和真皮，将真皮剪碎后，置于0.1%胶原酶中，37 ℃恒温摇床消化2 h，至组织块基本消失。1500 r/min离心5 min，收集沉淀，弃上清，细胞以DMEM+10% FBS制成细胞悬液，吹打均匀后以约2×105/cm2的密度接种于培养皿，于37 ℃、5% CO2、100%饱和湿度的条件下培养；接近80%融合时进行传代，比例约为1∶4。

1.2 小鼠皮肤成纤维细胞SIPS模型的建立 采用此前本研究小组确立的方法[4]。选用P2代细胞，当融合度为50%时，移去培养液，覆盖薄层PBS，打开盖子，置于UVB灯管(Philips TL 20 W/01 RS lamp)正下方，进行首次照射，照射剂量(使用Lutron UV light meter测量)为120 mJ/cm2。照射完毕后，吸去PBS，加入10 ml DMEM+1% FBS继续培养，每隔12 h照射1次，共4次，每次照射完毕后用含1% FBS的培养液继续培养；末次照射完成后用DMEM+10%FBS培养。

1.3 衰老相关蛋白表达检测 正常细胞或SIPS细胞末次照射48 h后，移去培养液，预冷PBS洗涤3次，培养皿移至冰上，加入蛋白裂解液200 μl，用1 ml针头反复吹打，转移至1.5 ml EP管中，冰上静置15 min；12 000 r/min，4 ℃离心15 min，取上清，用BCA法测定蛋白浓度，取各个处理组蛋白提取液，调整蛋白浓度，与等体积2倍上样缓冲液混合，煮沸并离心；电泳分离蛋白并将蛋白质转移至PVDF膜上，孵育袋中加入TEST稀释的p53、p21( abcam 1∶500)和GAPDH (boster 1∶2000)，4 ℃孵育过夜；采用辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(Jack-son 1∶2000)室温孵育2 h；采用ECL化学发光法显影和定影。

1.4 不同pH值时β-半乳糖苷酶组化检测及阳性分析 6孔板内生长的正常细胞或SIPS细胞PBS漂洗2次，室温下固定5～10 min(固定液含2%多聚甲醛和0.2%戊二醛)，加入新配制的SA-β-Gal染色液(2 mmol/L MgCl2，150 mmol/L NaCl，5 mmol/L K3Fe(CN)6，5 mmol/L K4Fe(CN)6，1 g/L X-Gal)，使用 HCl 或NaOH 分别调节pH为6.0、6.5、7.0、7.5和8.0。37 ℃无CO2孵育48 h，镜下观察，阳性物质为蓝色沉淀。采用Image-ProPlus图文分析系统，每个pH值条件下随机选取100细胞，测定每个细胞中阳性着色面积与该细胞总面积的百分比，取其均值作为SA-β-Gal阳性表达结果。

2 结果

2.1 细胞衰老相关蛋白的表达 细胞周期相关蛋白p53、p21作为细胞衰老的常用指标[5]，会随着细胞的老化而表达增加。我们从蛋白水平检测了p53和p21的变化，发现与P1代的正常年轻细胞相比，P6代和P12代细胞中两种蛋白的表达明显增高，而UVB照射引起的SIPS老化细胞中，两种蛋白的增加程度介于P6代和P12代细胞之间(图1)。

2.2 SA-β-Gal组织化学检测 pH为6时，SA-β-Gal组化检测及其阳性细胞的染色阳性面积百分显示，与P1代年轻细胞组相比，P6、SIPS以及P12衰老细胞组中，阳性面积百分比逐渐升高，且与衰老相关周期蛋白显示的衰老趋势相同，分别为67%、42%和32%。但是，随着pH值的升高，各衰老细胞组中阳性面积百分比逐渐降低(图2)。分别在pH7.0(P6代细胞)、7.5(SIPS细胞)、8.0(P12代细胞)时，SA-β-Gal染色阴性(图3)；且各组细胞在不同pH值时，阳性细胞的染色阳性面积百分比差异有统计学意义(图4，P<0.05)。

3 讨论

细胞衰老作为生物衰老的基本单位，在抗衰老相关研究中的地位也与日俱增，细胞衰老的有效评估指标也变得越来越重要[2,6]。与生殖细胞、干细胞和肿瘤细胞所不同的是，绝大多数的正常细胞由于缺乏端粒酶而复制能力有限，最终会因端粒的逐渐侵蚀而永久性复制阻滞导致细胞衰老[7-8]。此外，多种其他因素如癌基因的激活、DNA的损伤、过度增生以及活性氧刺激等，也可以造成细胞的应激性早衰[9]。现在认为，细胞衰老更是一种内在的抑癌机制[10]。近期的衰老相关研究也表明，体内衰老的细胞可以通过分泌多种细胞因子，蛋白酶和生长因子在组织修复、肿瘤转归和机体的老化等方面发挥复杂的作用[11]。因此，寻找可靠的细胞衰老生物学指标的重要性与日俱增。

图1 western blotting 检测p53，p21蛋白表达图2 应用图像处理工具标准化测量细胞SA-β-Gal着色 a.pH为6.0时，老化细胞的SA-β-Gal染色结果 b,c.使用Image-ProPlus图文分析系统对图2a中的着色细胞进行分析，手动标出细胞轮廓(2b)和着色范围(2c)图3 不同pH情况下，各组细胞的SA-β-Gal染色情况图4 不同pH情况下，计算100个随机视野下细胞着色情况以估算SA-β-Gal染色阳性面积百分比

Fig1 Expression of p53 and p21 detected by Western blotting.Fig2 Standardization assay of SA-β-Gal staining using a image processing tool. a. result of SA-β-Gal staining of MDF at pH 6.0. b. c. Image analysis of the stained cells( Figure 2a) using the Image-ProPlus and marking out the cell membrane borders (2b) and the stained area (2c) by hand.Fig3 The level of SA-β-Gal staining at different pH in the different group.Fig4 Estimation of positive area percentage of SA-β-Gal staining by analyzing random 100 cells under visual fields at different pH in the different group.

由于操作简单和特异性明显，SA-β-gal已广泛应用于体内外衰老细胞的检测[12-14]，甚至在某些衰老的研究中只依赖SA-β-gal一种检测。但SA-β-gal的细胞器来源及其在衰老细胞中的作用并未完全清楚。已有报道证实，SA-β-gal是溶酶体β-gal基因GLB1的产物[15]。在衰老细胞中，GLB1在mRNA和蛋白的水平上都有明显的升高，并且β-gal的活性也相应的升高[15]。在β-gal活性最佳的pH值4.5时所有细胞染色阳性，而在β-gal次优的pH值6.0时SA-β-gal被检测阳性[3]。但随着pH的升高，SA-β-gal在衰老细胞中的特异性如何变化并不十分清楚。本实验分别选取了不同生长阶段和SIPS的细胞[16]，代表年轻、正常老化和应激老化的细胞。通过周期蛋白P53/P21来检测评估各细胞组的老化程度，发现P1代、P6代、SIPS和P12代细胞衰老程度逐渐增加。随后，在不同pH条件下(6.0～8.0)，对各组细胞进行SA-β-gal检测，并通过对其染色阳性面积百分比统计分析，发现正常年轻P1代细胞SA-β-Gal染色阴性，其余组细胞随着pH值的由低到高(6.0～8.0)，SA-β-Gal着色情况均呈现由强到弱的变化趋势。但各组衰老细胞并未像之前报道的在pH为7.5时染色阴性[3]。实验结果显示，P6代细胞、SIPS细胞、P12代细胞分别在pH 7.0、7.5和8.0时,SA-β-Gal着色特异性消失。

本实验结果提示，pH值7.5并不是SA-β-Gal染色结果阳性与阴性的分界点，对于衰老程度较高的细胞，pH大于7.5时SA-β-Gal染色依然存在阳性结果，而且细胞衰老程度越高，使SA-β-Gal染色达到阴性所需的pH值也越高，只要在SA-β-Gal染色阳性存在的情况下，pH大于6.0仍可以特异性的表现细胞相对衰老程度。这也说明衰老细胞中SA-β-Gal染色所检测到的β-gal除与细胞中溶酶体的增多相关外，也可能受其他未知因素的影响，比如说衰老细胞中溶酶体功能的差异[15]、随细胞衰老而最适pH不同的次级溶酶体以及溶酶体残体的增多等[3]。同时实验结果表明，染色阳性面积百分比与阳性细胞计数的方法相比,更能敏感、有效的反映细胞衰老情况，这不仅为细胞衰老染色及分析提供实验性的新手段，同时为细胞抗衰老以及年轻化的相关研究提供实验依据。

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EffectofpHonsenescenceassociatedβ-galactosidasestaining

CHENLiang,BIBo,ZENGJi-ping,etal.

(DepartmentofPlasticandReconstructiveSurgery,HuaDongHospital,FuDanUniversity,Shanghai200040,China)

ObjectiveTo investigate the alteration of the level of senescence-associated β-galactosidase (SA-β-Gal) in the mouse dermal fibroblasts (MDF) of replicative senescence and stressinduced premature senescence (SIPS) in different pH staining solutions.MethodsMDF were harvested from dorsal skin of newborn 1-3 d C57BL/6 mice for serial subcultivation. The SIPS cells were induced by repeated UVB irradiation. The aging process was evaluated by western blotting of p53/p21 protein and senescence-associated and β-galactosidase histochemical staining was also performed in different pH solutions. The staining results were observed and analyzed.ResultsThe expression of p53 and p21at the P1、P6、SIPS and P12 cells was increased in turn; SA-β-Gal staining was negative at P1cells. With the increasing of pH (6.0-8.0), the positive percentage of SA-β-Gal staining in the other cells decreased, the positive expression in the P6、SIPS and P12 disappeared at pH of 7.0, 7.5, and 8.0, respectively.ConclusionWith the development of cell senescence, SA-β-Gal staining would show the a false negative when the pH value increased, suggesting that the safe pH range for SA-β-Gal staining should be determined with corresponding passages taken into account.

Cell senescence; pH; Senescence-associated β-galactosidase

国家自然科学基金资助项目(81272125；81301642)；上海市卫生系统优秀学科带头人培养计划资助项目(XBR2011033)；863资助项目(SS2014AA020705)

200040 上海，复旦大学附属华东医院 整形外科

陈 亮(1988-)，男，山东淄博人，硕士研究生.

刘天一，200040，复旦大学附属华东医院 整形外科，电子信箱：tianyiliucn@163.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2014.12.018

R329.2

A

1673-7040(2014)12-0751-04

2014-07-10)