离子液体微波辅助萃取穿心莲中内酯类化合物△

陈嘉曦，李尚德

(广东医学院 药学院，广东 东莞 523808)

广东医学院项目(M2012014)

*

陈嘉曦，实验师，研究方向：药物化学和生物化学；E-mail：cppcc@qq.com

离子液体微波辅助萃取穿心莲中内酯类化合物△

陈嘉曦*，李尚德

(广东医学院 药学院，广东 东莞 523808)

目的以离子液体为萃取剂，采用微波辅助萃取法(MAE)对穿心莲中的穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的萃取进行研究。方法考察了温度、时间、相比和原药粒径等因素对萃取效果的影响，比较了MAE和传统溶剂回流萃取法(HRE)的萃取率。结果以离子液体([Bmim]Tf2N)为萃取剂，液固比(mL∶g)10∶1，80 ℃微波辅助萃取3 min，穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的萃取率分别为16.08 mg·g-1和4.76 mg·g-1。结论与传统的萃取方法比较，本方法快速高效、对环境无污染。

穿心莲；微波辅助萃取；离子液体；穿心莲内酯；脱水穿心莲内酯

穿心莲Andrographispaniculata(Burm.f.)Nees为爵床科穿心莲属植物，别名一见喜、斩蛇草、苦草、橄榄莲，原产于印度，现广泛分布于我国福建、广东、广西、海南、云南等地。穿心莲为常用中药，具有清热解毒，凉血，消肿功能。用于感冒发热，咽喉肿痛，口舌生疮，顿咳劳嗽，泄泻痢疾，热淋涩痛，痈肿疮疡，蛇虫咬伤[1]。

微波辅助萃取技术，具有设备简单、适用范围宽、萃取效率高、重现性好、节省时间、节省试剂等特点，被广泛应用于天然产物萃取[2]。在微波辅助萃取中草药中有效活性成分时，萃取溶剂需要有一定的极性才能吸收微波进行内部加热，通常选用极性较强的溶剂或者是极性溶剂和非极性溶剂的混合液，如甲醇、乙醇、二氯甲烷-甲醇、水-甲苯等，但这些挥发性有机溶剂在样品前处理过程中会引起环境污染。最近几年离子液体、表面活性剂等各种新型的绿色溶剂开始用于微波辅助萃取，并取得了良好的萃取效果[3]。离子液体是由有机阳离子和无机(有机)阴离子构成的在室温或接近室温下(通常低于100 ℃)呈液体状态的盐类[4-6]，非常适合做MAE萃取溶剂，因为离子液体是由离子组成的，具有蒸气压低、挥发性小、溶解能力强、萃取能力好、液态范围宽等独特的物理化学性质，同时对微波具有强的吸收和热转换能力[7]。将离子液体作为萃取剂、微波吸收剂，采用微波辅助萃取，较好地发挥了离子液体与微波技术的优势，为天然产物绿色、高效萃取提供了新方法。

本实验以穿心莲药材中穿心莲内酯(andrographolide)、脱水穿心莲内酯(dehydroandrographolide)这两种内酯类化合物为目标，以微波为辅助萃取手段、离子液体1-丁基-3-甲基咪唑双三氟甲基磺酰亚胺鎓盐([Bmim]Tf2N)为萃取剂及微波吸收剂，对影响萃取的主要因素，如萃取温度、萃取时间、原药粒径、相比(固/液)等工艺参数进行了系统研究，并以反相HPLC为表征手段，对两种穿心莲内酯类化合物进行了定量分析，为中药中活性成分的萃取开拓了新思路。

1 材料与仪器

1.1 试药

穿心莲样品(湛江穿心莲规范化种植基地，茎与叶混合)；穿心莲内酯对照品(批号：0797-200206)、脱水穿心莲内酯对照品(批号：0854-200204)，购自中国食品药品检定研究院。甲醇为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。离子液体([Bmim]Tf2N)根据文献所述方法制备[8]。产物用1H-NMR 和13C-NMR检测离子液体的纯度，NMR谱图表明离子液体中没有其他有机杂质。

1.2 实验装置与分析仪器

MDS-10高通量微波消解萃取合成工作站(上海新仪微波化学科技有限公司)；Agilent1100系列高效液相色谱仪，Agilent自动进样器，Agilent DAD检测器；Agilent extend C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。

2 方法

2.1 微波辅助萃取(MAE)

将穿心莲自然晾干、粉碎成粉、过筛，得到<0.096，0.096～0.15，0.15～0.18和0.18～0.25 mm 4种不同粒径样品。准确称取0.5 g穿心莲样品于放有转子的反应管中，加入5 mL[Bmim]Tf2N，用磁力搅拌器搅拌，使穿心莲粉末尽量均匀分散在[Bmim]Tf2N相中。萃取实验结束后，用甲醇定容50 mL，待测。

2.2 溶剂回流萃取(SRE)

精密称取穿心莲药材干燥粉末(60 ℃干燥)1.0 g，加甲醇100 mL，索氏提取至馏出液为无色(约3.5 h)，萃取液用旋转蒸发仪蒸出大部分溶剂，再用甲醇将其定容为100 mL。

2.3 对照品溶液的配制

精密称取穿心莲内酯对照品和脱水穿心莲内酯对照品适量，加甲醇溶解，摇匀，制成每l mL含穿心莲内酯0.1 mg和脱水穿心莲内酯0.1 mg的对照品溶液。

2.4 HPLC定量方法

分别准确吸取穿心莲内酯与脱水穿心莲内酯对照品溶液、样品溶液5 μL，以0.45 μm微孔滤膜过滤，注入HPLC色谱仪，进行分析，测定时间为1 h，流动相为以甲醇-水(30∶70)0～60 min(60∶40)梯度洗脱，流速：1.0 mL·min-1，检测波长：226 nm，柱温：25 ℃。结果见色谱图1、2。色谱图中，在RT9.584、15.016、21.218、24.204、26.549、38.312、44.444和46.112处分别有明显的色谱峰，这8个色谱峰为穿心莲有效成分的主要特征色谱峰和共有色谱峰。

图1 穿心莲内酯与脱水穿心莲内酯对照品HPLC图

图2 穿心莲药材HPLC图

2.5 微波辅助离子液体萃取法的标准曲线制备

精密称取穿心莲内酯8.55 mg、脱水穿心莲内酯对照品20.75 mg，置于50 mL 量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每l mL 中含穿心莲内酯171.0 μg和脱水穿心莲内酯415.0 μg的对照品溶液，备用。分别精密吸取上述对照品溶液1，2，4，6，8，10 mL，分别置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，进样测定。以对照品进样浓度为横坐标(X)，峰面积积分值为纵坐标(Y)绘制标准曲线，得穿心莲内酯回归方程为Y=3.844×10-5X+2.575，r=0.999 9；脱水穿心莲内酯回归方程为Y=5.840×10-5X+4.453，r=0.999 9。结果表明穿心莲内酯进样浓度在17.1～171 μg·mL-1与穿心莲内酯峰面积呈良好的线形关系。脱水穿心莲内酯进样浓度在41.5～415μg·mL-1与穿心莲内酯峰面积呈良好的线形关系。

2.6 加样回收率试验

准确称取穿心莲样品0.5 g，分别精密加入混合对照品溶液(穿心莲内酯6.50 mg·mL-1、脱水穿心莲内酯2.00 mg·mL-1)1 mL，按照建立的微波辅助萃取方法提取，每个实验重复5次，计算回收率。结果见表1。

表1 穿心莲中两种内酯的回收率试验

注：穿心莲内酯对照品加入量为6.500 mg，脱水穿心莲内酯对照品加入量为2.000 mg

3 结果

3.1 萃取影响因素

3.1.1 温度对萃取的影响 如图3所示，穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的萃取效率均随温度升高而提高，其中，穿心莲内酯的萃取效率在80 ℃时达最高，脱水穿心莲内酯在系统温度为90 ℃时萃取率最高。因样品中穿心莲内酯含量远高于脱水穿心莲内酯，综合考虑，选择实验萃取温度为80 ℃。

3.1.2 时间对萃取的影响 如图4所示，萃取在2 min时几乎达到平衡，随时间延长，萃取效率几乎没有变化，因此实验反应时间为3 min已经能萃取完全。这也证明了微波辅助萃取法不仅能节约时间，同时在能量利用上也实现了节约、高效。

图3 萃取温度对萃取的影响

图4 萃取时间对萃取的影响

3.1.3 粒径对萃取的影响 对4种粒径(<0.096，0.096～0.15，0.15～0.18、0.18～0.25 mm)穿心莲样品中穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的萃取进行了考察，发现粒径对萃取影响较小，萃取效率差别不大。

3.1.4 相比对萃取的影响 离子液体对穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的萃取效率在固体/液体比为1∶30～1∶10(g∶mL-1)没有显著变化。可见，在工艺条件允许范围内，相比对萃取影响较小，离子液体单次萃取并未达到饱和。基于以上数据，最终选择1∶10(g∶mL)为最终提取的固液比条件。

3.2 微波辅助离子液体萃取与传统萃取方法比较

如表2所示，微波辅助离子液体萃取法(MAE)对穿心莲内酯类化合物的萃取效率显著比甲醇回流萃取法(HRE)高，对穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的提取率分别提高38%和33%。

对比MAE和HRE，在萃取穿心莲样品时，MAE具有较特别的热力学和动力学机理[9-10]，在相同萃取条件下具有显著的优势。从表2可知，采用MAE技术，利用离子液体([Bmim]Tf2N)为萃取剂，不仅穿心莲内酯类化合物的萃取率高，回收率好，并可避免挥发性有机溶剂的使用，另外微波萃取法用时短，所需溶剂量小。以固液比(g∶mL)10∶1、80 ℃微波辅助萃取3 min，穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的萃取率分别为16.08 mg·g-1和4.76 mg·g-1。

表2 穿心莲微波辅助离子液体萃取与传统萃取方法比较

4 讨论

目前穿心莲药材及其制剂的质量控制和评价多以穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯含量为指标。《中国药典》2010版规定穿心莲药材质量控制方法为测定穿心莲内酯与脱水穿心莲内酯的含量，两者的总量不得少于0.8%，本实验穿心莲药材的穿心莲内酯类化合物超过2.1%。上述研究结果表明，温度是影响萃取的最主要因素。温度较低时进行微波辅助萃取，微波破坏细胞壁使有效成分得到释放，在达到最大萃取效率前，萃取效率呈上升趋势；达到某一温度后，细胞结构完全被破坏；而当萃取温度超过该临界温度后，过高的温度又会破坏或改变穿心莲中某些成分的分子结构，使表观上萃取效率有所下降[11]。因此，可推断微波辅助离子液体萃取效率的提高是微波破坏作用与热效应的协同作用，并且以离子液体为溶剂，采用微波辅助萃取的机理与传统有机溶剂的萃取机理基本一致[12]，采用该方法萃取穿心莲中的穿心莲内酯类化合物，快速、高效，对环境无污染。

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Microwave-assistedExtractionofLactonefromAndrographisPaniculataUsingIonicLiquidMAEMethod

CHENJiaxi*，LIShangde

(SchoolofPharmacy，GuangdongMedicalCollege，Dongguan，523808，China)

A microwave-assisted extraction(MAE)method was used to extract andrographolide and dehydroandrographolide fromAndrographispaniculata(Burm.f.)Nees.Ionic liquid was employed as extractant.Influential factors such as system temperature，extraction time，phase ratio and particle size were examined.The yield of the two target ingredients was compared between MAE and solvent reflux extraction(HRE).The optimal MAE conditions were：the solvent was [Bmim] Tf2N solution，the ratio of liquid/solid(mL∶g)was 10∶1，the extraction temperature was 80 ℃，and time was 3 min.Under this condition，the yields of andrographolide and dehydroandrographolide were 16.08 mg·g-1and 4.76 mg·g-1respectively.

Andrographispaniculata(Burm.f.)Nees；Microwave-assisted extraction；Ionic liquids；Andrographolide；Dehydroandrographolide

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.05.015

2013-12-24)