新疆石河子-沙湾地区博尔通古牧场硬蜱形态学和16S rDNA序列分析研究

张璘 ，李永祥 ，张科 ，杜景云 ，陈创夫 ，王开胜 ，王远志 ，

（1石河子大学医学院感染免疫教研室，石河子 832002；2石河子大学动物科技学院，石河子 832003）

博尔通古牧场位于石河子-沙湾地区，是当地重要的牧业区。主要以山地草原、针阔混交林、河畔灌丛及林间芨芨草地、半荒漠草原沙丘等地貌构成，牛、羊放牧量每年超过10万头，为硬蜱的生存、繁殖提供了良好条件[1]。

蜱属节肢动物门（Arthropoda）、蛛形纲（Arachnida）、寄螨目（Parasitiformes）、蜱亚目（Ixodida），其中最常见、危害最严重的是硬蜱[2-3]。据文献[4]记载新疆迄今已发现蜱类2科9属42种，占全国已知蜱类的1/3以上。传统的蜱类分类主要依据蜱的形态学和生态学特性的相似或差异程度[5-7]，但蜱虫形态学的鉴定需要鉴定人员具有丰富的专业知识和鉴定经验，并且在形态学方面对未成熟个体 （卵、幼虫）及不完整的个体标本难以鉴定[8]。相比传统的形态学鉴定方法，分子生物学更容易掌握与操作，且随着其研究技术的发展，已应用到蜱类的物种鉴定和种群研究中[9]。由于分子生物学技术开始越来越多地应用于蜱类系统发育学研究，因此出现了蜱类的分子系统发育学研究[10]。16S rDNA是动物线粒体较保守的基因，进化速率缓慢，以替换为主，可很方便地用保守引物或通用引物定位并进行PCR扩增[11-14]，所以16S rDNA 已广泛应用到蜱的分类及系统进化研究中。

本研究利用传统形态学分类方法对采集的该区域蜱种进行初步鉴定，同时其16S rDNA基因进行扩增、测序，分析该区域蜱种与国内外蜱种的遗传进化关系，旨在探讨新疆石河子-沙湾地区博尔通古牧场蜱种的地域特征性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1调查地点

博尔通古牧场位于北纬 43°26’～45°46’， 东经84°57’～86°09’，全场总面积 1300 hm2，距新疆沙湾县城西37 km，东邻沙湾县安集海镇，西依奎屯市、独山子区，北与第八师（石河子）131、132、133、141、142团等团场相连。

1.1.2实验材料

1.1.2.1 虫体来源

2012年4-5月，从博尔通古牧场的12个畜群（未药浴）中每群随机抽取绵羊、奶牛各10～20头，采集其体表寄生蜱，共获得551只硬蜱（323只蜱采自羊，228只蜱采自牛），于-80℃冰箱中保存备用。

1.1.2.2 主要试剂

PCR所用试剂均购自大连宝生物工程有限公司；DNA提取试剂盒DNeasy Blood&Tissue kit购自德国Qiagen公司；其它所用试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1形态学鉴定

采用解剖显微镜（LEICA M165 C）进行观察，并采集图片，并量长度，参照文献[15]，进行初步形态学鉴定，分别置于1.5 mL的Eppendorf管，并编号。

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1.2.2虫体的处理和DNA提取

将上述编号后的蜱，分别依次用浓度为70%、50%、30%、10%的酒精溶液于37℃摇床中冲洗1 h，再用超纯水反复冲洗，干燥。最后置于消毒灭菌的1.5 mL EP管中。按照DNA提取试剂盒使用说明书提取虫体基因组DNA，置于-20℃保存备用。

1.2.3 PCR扩增及引物设计

PCR扩增与测序参考文献[11]设计引物。

上 游 引 物 ：5’-CTGCTCAATGATTTTTTAAATTGCTGTGG-3’；

下 游 引 物 ：5’-CCGGTCTGAACTCAGATCAAGT-3’。

扩增线粒体16S rDNA序列，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

25 μL PCR 反应体系：模板 1.5 μL(约 50 ng)，上游和下游引物各 0.75 μL（75 pmol），50 mmol/L KCl，10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.3），1.5 mmol/L MgCl2，1 单位Taq DNA聚合酶。 PCR反应循环参数为：94℃预变性5 min，92 ℃ 变性30 s，54℃ 退火 30 s，72℃延伸60 s，共38个循环，72℃终延伸8 min。扩增16S rDNA片段后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.2.4序列分析及系统树构建

研究结合GenBank登录的34个16S rDNA参考序列 （对应蜱种来源与新疆石河子-沙湾地区处于相近的纬度），将本实验PCR扩增的序列测序后与参考序列比对，通过生物学软件MEGA5.0进行遗传进化树和遗传距离分析。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定

共鉴定2科3属：分别为革蜱属（Dermacentor）、璃眼蜱属（Hyalomma）、和血蜱属（Haemaphysalis）。其种类及其相对优势度见表1。

由表1可见，血蜱属为优势属和常见属。上述3个属经鉴定，有4个种：刻点血蜱、亚洲璃眼蜱、边缘革蜱、草原革蜱或/和森林革蜱，其形态见图1。

表1 寄生蜱的种类(种)及相对优势度Tab.1 The species and the relative dominance of parasitic ticks

图1 背面和腹面观图Fig.1 The ventral and doesal structure

2.2 16S rDNA部分基因序列比对及系统进化树

PCR扩增蜱16S rDNA基因，产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，出现1条约460 bp片段，与预期目的片段一致。运用MEGA 5.0进行多重序列比对后构建系统进化树，结果见图2。

图2 基于16S rDNA进行蜱种系统进化树分析Fig.2 Phylogenetic tree of representative tick specimens inferred from 16S rDNA

不同科属间16S rDNA基因序列比较结果显示同源性均在75%以上，其中2种硬蜱(Der1、Der2)与边缘革蜱 （Accession NO:Z97879）同源性分别为98.2%和96.8%，遗传距离为0.021和0.026；1种硬蜱(Der3)与森林革蜱（Accession NO:JF979379）、草原革蜱 （Accession NO:JF979375）同源性分别为95%和 96.3%，遗传距离为 0.039和 0.042（表 2）；3种硬蜱(Hya1、Hya2、Hya3)与亚洲璃眼蜱（Accession NO:JF979380）同源性为 98.3%～99.8%，遗传 0.003～0.017（表 3）； 且 1种硬蜱 (Hae)与刻点血蜱（Accession NO:Z97880）同源性完全相同。

表2 基于16S rDNA分析Der1、Der2、Der3与边缘革蜱、草原革蜱、森林革蜱的遗传距离Tab.2 Phylogenic analysis of Der1,Der2 and D.marginatus，D.silvarum，D.nuttalli by pairwise distance based on 16S rDNA

表3 基于16S rDNA分析Hya1、Hya2、Hya3与亚洲璃眼蜱的遗传距离Tab.3 Phylogenic analysis of Hya1,Hya2,Hya3 andH.asiaticumby pairwise distance based on 16S rDNA

3 讨论与结论

新疆石河子-沙湾地区博尔通古牧场属大陆性中温带干旱气候，年平均气温6.3～6.9℃，日照时数2800～2870 h，无霜期平均为 165～190 d。 年降水量140～350 mm，年蒸发量 1500～2000 mm。且牧场中畜牧主要为放养型，放牧的草场根据季节分为冬营盘和夏营盘，冬营盘位于天山山麓。本实验样本采集于4、5月份，正处于畜牧群从冬营盘迁入夏营盘时期。

测序结果与美国国立生物技术信息中心网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)报道的序列进行比对，结合形态学及分子生物学分析结果可知，共鉴定2科3属4种：刻点血蜱、亚洲璃眼蜱、边缘革蜱、草原革蜱或/和森林革蜱。序列分析结果可见，尽管新疆沙湾县博尔通古牧场牛、羊源硬蜱种类与以往形态学研究结果大致相当，但有其自身的特点：

（1）原属于天山北麓优势蜱种此次调查中未全部发现；（2）形态学初步鉴定中与扩增16S rDNA序列的结果之间存在差异；（3）部分蜱种，其序列与国际报道的16S rDNA序列不同，存在不同程度的差异，可能由不同的生境、寄生宿主导致的遗传进化有关。

本次调查结果发现，只有边缘革蜱与以往研究地理位置报道一致，但其他蜱种均为石河子-沙湾地区首次报道。另外，新疆优势蜱种，如全沟硬蜱、草原硬蜱、嗜群血蜱、新疆血蜱、银盾革蜱等[16-19]，但本次调查中未发现，这可能与博尔通古特牧场2012年春夏季节雨水过少、特殊的植被分布及气候改变有关。

在革蜱属中森林革蜱与草原革蜱是较为相似的蜱种，均寄生于哺乳类动物和小型家畜，其生活史极为相似，但其外观有一定差异[20]。而通过基于16S rDNA基因遗传距离结果可知，两者间仅有约1.2%差异。可能该种蜱于此段基因变异率较低，可增加分子分型位点以区分森林革蜱与草原革蜱。此外，本研究只以新疆沙湾县博尔通古牧场寄生硬蜱为调查对象，具有一定的局限性。因此，今后需增加调查地点，并对不同宿主寄生硬蜱进行系统研究。

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