运动和药物干预对2型糖尿病大鼠骨髓瘦素及其受体蛋白表达的影响

宫 华，高海宁，常 波

(1.辽宁师范大学体育学院，辽宁大连116029;2.沈阳体育学院运动人体科学学院，辽宁沈阳110102)

近年来，糖尿病与骨质疏松的关系引起越来越多的学者关注，糖尿病患者常常并发骨代谢异常，流行病学研究证实［1］糖尿病患者骨质疏松的发病率为40% ～66%。研究发现［2］，瘦素及其受体在骨的生长发育中可能起到关键作用，但仍需继续研究糖尿病会对患者骨骼的瘦素、瘦素受体水平造成怎样的影响，有氧运动和药物干预对改善瘦素及其受体水平能否起到联合增效作用，运动与药物结合对2型糖尿病糖代谢的改善作用是否与运动改善瘦素抵抗有关。本研究探讨不同干预方式对2型糖尿病大鼠血清骨代谢指标及骨骼瘦素、瘦素受体水平的影响，为揭示治疗2型糖尿病大鼠骨质疏松的机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验对象

6周龄的雄性SD大鼠59只(由中国人民解放军军事医学科学实验动物中心提供)，分笼饲养，自由摄取饮食饮水，每日记录饮食量。

1.2 实验方法

将大鼠按体重随机分为5组，分别为正常饮食对照组(NCG)、糖尿病安静组(DCG)、糖尿病运动组(ETG)、糖尿病药物组(DTG)、糖尿病药物运动组(ETDTG)。正常饮食对照组以普通饲料喂养，其余4组为糖尿病模型组，采用6周高脂高糖饲料肥胖造模后加以STZ注射方法进行糖尿病造模，注射后72 h血糖值不低于16.7 mmol/L为造模成功，造模未成功的大鼠继续注射STZ直到成功。

造模成功后对糖尿病运动组和糖尿病药物运动组进行为期6周的游泳训练。第1周为适应性训练，第1天游泳10 min，以后每天增加10 min，适应期结束后保证大鼠能连续游泳50 min;第2周开始50 min*2组、组间歇50 min的强度进行游泳训练。

实验过程中由于高血糖和药物及运动等多种原因造成大鼠死亡10只，最终采样时各组大鼠数量如表1所示。于末次运动结束后24 h、禁食12 h后取材，麻醉(氨基甲酸乙酯1.5 ml/kg)后腹腔静脉取血，3 500 rpm离心10 min分离血清，置于－80℃环境保存待检。老鼠断头处死后，迅速分离股骨，去除肌肉和结缔组织后，用浸透生理盐水的纱布包裹股骨，用于测定骨髓中瘦素、瘦素受体。

1.3 测试指标与方法

1.3.1 血液指标测试 使用血糖仪测试空腹血糖(GLU);放射免疫法测试血清胰岛素(Insulin)，血清碱性磷酸酶(AKP)、血清钙离子(S-Ca)、血清磷离子(S-P)使用专用试剂盒(南京建成生物工程研究所)，采用半自动生化分析仪进行测试。

1.3.2 骨髓瘦素、瘦素受体蛋白表达测定 组织称重后将组织块剪碎，加入裂解液(组织质量:裂解液体积=1 mg:5 μl)、蛋白酶抑制剂(组织质量:蛋白酶抑制剂体积=100 mg:1 μl)匀浆、超声粉碎，4℃，12 000 rpm条件下离心20 min后提取样本上清液。酚试剂法定蛋白浓度后，按照各样本上清液体积(μl)=各样本蛋白浓度最低值×100/各样本最低浓度公式制备样品，加入20 μl6×buffer。离心温度为4℃，转速为3 000 rpm，离心3 min，煮沸5 min。

凝胶后各组样本上样6 μl，进行电泳(电压条件为浓缩胶80 V，分离胶120 V)，电泳完成后，瘦素50 V转印1 h，瘦素受体70 V转印2 h后，PVDF膜用TBST清洗(3次×5 min)用含5%的脱脂奶粉的封闭液封闭2 h。取出PVDF膜后，用TBST清洗(3次×5 min)。放入孵育袋中，加入各测试指标的一抗(抗体体积:抗体缓冲液体积 =1 μl:500 μl)。用封口机封口，平放于4℃冰箱中过夜。孵育袋中加入碱磷酸酶标记的二抗(抗体体积:抗体缓冲液体积=1 μl:1 000 μl)，室温下孵育 2 h。用 TBST 洗膜(3次×5 min)，酶显法即显色剂显色，用凝胶成像分析软件FlourChem V 2.0对条带进行分析，记录每条蛋白条带的灰度值。

1.4 统计学方法

用统计软件SPSS 16.0处理数据，多组间数据比较用单因素方差分析，所有统计结果用平均数±标准差表示。

2 实验结果

表1显示:糖尿病各组在注射STZ前体重均显著高于NCG组，且已超过NCG组的25%，达到肥胖的标准。DCG组体重高于NCG组(P＜0.05)，ETG组、DTG组、ETDTG组与DCG组比，体重均有下降的趋势，只有ETDTG组有统计学意义(P＜0.05)。

表1 各组大鼠体重

表2 血清血糖和胰岛素的变化情况

由表2可见，DCG组与NCG组相比，血糖水平及胰岛素水平有显著升高(P＜0.01，P＜0.01)，ETDTG组的血糖水平及胰岛素水平比DCG组显著下降(P ＜0.01，P ＜0.01)。

表3 血清碱性磷酸酶及血清钙离子、磷离子的变化情况

由表3可见，DCG组与NCG相比，血清碱性磷酸酶有显著性升高(P＜0.01)，ETG组、DTG组及ETDTG组血清碱性磷酸酶水平与DCG组相比有下降的趋势，ETG组及ETDTG组下降趋势明显，有统计学差异(P＜0.05，P＜0.05)。ETDTG组血清碱性磷酸酶水平与ETG组比显著下降(P＜0.05)。DCG组与NCG组相比，血清磷离子有显著升高(P＜0.01)，ETG组、DTG组及ETDTG组血清磷离子水平与DCG组相比均显著下降(P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01)。ETDTG组血清磷离子水平与ETG组比较显著下降(P＜0.05)。DCG组与NCG组相比，血清钙离子有显著升高(P＜0.01)，ETG组、DTG组及ETDTG组血清钙离子水平与DCG组相比均有下降的趋势，只有ETDTG组降低趋势明显，且有统计学差异(P＜0.05)。ETDTG组血清钙离子水平与ETG组比较显著下降(P＜0.05)。

表4 瘦素及瘦素受体的变化情况

由表4、图1、图2可见，DCG组与NCG相比，瘦素水平显著升高(P＜0.01)，ETG组、DTG组及ETDTG组瘦素水平与DCG组相比明显下降(P＜0.05，P＜0.05，P ＜0.01)。ETDTG 组瘦素水平与ETG组比显著下降(P＜0.05)。DCG组与NCG组相比，瘦素受体水平显著下降(P＜0.01)，ETDTG组骨髓瘦素受体水平比DCG组、ETG组显著升高(P＜0.05，P ＜0.05)。

图1 各组大鼠瘦素水平

图2 各组大鼠瘦素受体水平

3 分析与讨论

糖尿病能导致多种并发症，近年来骨质疏松作为一种常见的并发症引起了越来越多学者的关注。瘦素是调节机体能量代谢的重要物质，大量研究证明［3］瘦素、瘦素抵抗与糖尿病的发生发展密切相关。然而瘦素水平的改变是否是导致糖尿病骨质疏松的原因、能否通过改善瘦素抵抗来改善糖尿病患者的骨代谢研究结果并不明确。

空腹血糖是诊断糖尿病的重要依据，2型糖尿病患者的临床表现为空腹血糖水平高、三多一少。胰岛素具有降低血糖水平的功能，2型糖尿病患者体内胰岛素水平过高，但不敏感，胰岛素与胰岛素受体结合率下降，表现为高血糖、高胰岛素症状，这种现象称为胰岛素抵抗。本研究结果显示，DCG组与NCG组相比，血糖水平、胰岛素水平有显著升高(P＜0.01，P＜0.01)，可见长期高糖高脂饮食联合小剂量STZ可以造成大鼠空腹血糖水平升高，长期的高血糖水平刺激机体分泌更多的胰岛素，导致胰岛素水平显著升高，并产生了胰岛素敏感度降低，不能有效调节血糖水平的现象，即产生了胰岛素抵抗，高空腹血糖水平以及胰岛素抵抗现象证明了造模成功。研究证实，有氧运动可以提高肌细胞对葡萄糖的利用率，降糖药物能够提高胰岛素敏感性，增加外周组织对葡萄糖的摄取，但是本研究结果显示，ETG组和DTG组的血糖水平及胰岛素水平与DCG组相比均有下降的趋势，但不具有统计学意义，而ETDTG组明显下降(P＜0.05)可能与运动周期短、药物周期短、剂量不恰当有关，同时也证实联合干预效果比单一干预明显。

碱性磷酶酶(AKP)是碱性环境中水解磷酸酯的一组酶类。该酶广泛分布于生物体各组织中，在骨质疏松的发生、发展过程中，常伴随碱性磷酸酶总活性的改变［4］。碱性磷酸酶由成骨细胞产生，与骨钙化作用密切相关。大量研究显示［5－6］，骨质疏松可以促进成骨细胞内碱性磷酸酶释放入血，表现为血清碱性磷酸酶水平上升。本研究显示，DCG组碱性磷酸酶水平显著高于NCG组(P＜0.01)，提示糖尿病对照组大鼠可能存在骨质疏松。ETG组大鼠碱性磷酸酶水平显著低于NCG组大鼠，说明6周持续运动可以改善糖尿病大鼠骨质疏松症状，致使血碱性磷酸酶下降。DTG组大鼠碱性磷酸酶水平比DCG组有下降趋势，但无显著差异，说明二甲双胍可以影响大鼠血清碱性磷酸酶水平，对大鼠骨质疏松有一定的改善作用，但作用不明显。ETDTG组研究结果表明，运动联合药物干预对改善大鼠骨质疏松有一定效果。糖尿病除对碱性磷酸酶水平有影响外，也对钙、磷离子影响较大。糖尿病病情若长期不能控制，则会造成钙、磷丢失，出现骨质疏松。Woitge等［7］研究显示，有氧运动可减少骨中离子流失，12周负重(负体重的2%)游泳训练可使胫骨骨离子含量(Ca、P)增高(P＜0.05)。本实验选中小强度的有氧耐力运动对糖尿病大鼠进行干预。研究结果显示，中小强度有氧运动对血清钙离子影响不明显，但能显著提高血清磷离子浓度，这与翁锡全等人的研究结果一致。vestergard［8］研究显示，二甲双胍能降低2型糖尿病患者骨折的发生率，可能对骨组织有保护作用。cortizo等［9］研究发现二甲双胍能够诱导成骨细胞生长和分化，增加细胞外基质矿化。本研究结果显示，二甲双胍药物干预提高了糖尿病大鼠血清磷离子的浓度，对血清钙离子浓度影响不大，运动联合药物干预能够有效提高血清钙离子、磷离子的浓度。

瘦素是一种分泌型蛋白质，是重要的内分泌调节因子。瘦素与其靶细胞表面的瘦素受体结合后发挥调节脂类代谢和能量平衡的作用。有研究表明，瘦素与骨代谢联系密切，骨髓基质细胞具有向骨化细胞或脂肪细胞分化的潜能，瘦素可以使脂肪细胞成熟水平下降，抑制骨髓基质细胞向脂肪细胞分化，因而认为，瘦素可以促进骨髓基质细胞向骨化细胞的分化。骨质疏松患者骨髓基质细胞的骨化能力降低，考虑与瘦素水平变化有关。Gordeladze等［10］研究发现瘦素可以刺激骨化细胞的增殖、分化与矿化，保护分化成熟的骨化细胞，使之凋亡减少，促使骨化细胞转化为骨细胞。瘦素需要通过与瘦素受体结合发挥作用，Kastin［11］等实验研究发现肥胖可使正常人血瘦素受体数目下调，mRNA表达下降;Ritchie IR［12］等研究发现，经过4周高脂膳食，雌性SD大鼠骨骼肌瘦素水平上升，瘦素敏感性下降。由此可见，2型糖尿病患者体内游离瘦素水平升高，瘦素敏感性下降，瘦素受体不足，是发生瘦素抵抗的原因。本实验研究发现，DCG组比NCG组骨髓瘦素水平显著升高，瘦素受体水平显著降低(P＜0.01，P＜0.01)，提示DCG组大鼠发生了瘦素抵抗现象，结合该组大鼠骨代谢指标变化特点，证实了DCG组大鼠瘦素抵抗与骨质疏松的合并发生，可以推断2型糖尿病大鼠瘦素敏感性下降、瘦素受体相对不足导致了其骨质疏松的发生。

运动干预及药物干预对肥胖、糖尿病患者的瘦素水平有不同程度的影响，运动干预对糖尿病病情的缓解作用与运动强度和运动量有关。有研究显示，不同强度的运动对瘦素水平的影响不同，Ryan［13］研究发现，50～69岁绝经妇女在16周耐力训练运动干预后，身体质量下降组血清瘦素水平明显低于对照组。Pasman等［14］对成年男性肥胖者进行为期16个月的耐力训练，在训练开始及训练后第2、4、10、16个月检测血液瘦素水平，结果显示血瘦素水平降低，且降低水平与训练时间显著相关。孙焱等对不同运动时间大鼠的血清瘦素水平进行分析，在实验中将雄性SD大鼠随机分为肥胖对照组、45 min游泳运动组、90 min游泳运动组和150 min游泳运动组，进行为期8周的游泳训练后，各运动组大鼠血清瘦素水平与对照组相比均无显著性差异。本实验对糖尿病大鼠进行为期6周的中小强度游泳运动干预，ETG组大鼠比DCG组大鼠骨髓瘦素水平显著下降(P＜0.05)，瘦素受体水平无明显变化(P＞0.05)，提示6周中小强度游泳运动对改善糖尿病大鼠瘦素抵抗有一定作用。对骨代谢指标的研究显示，运动干预对糖尿病大鼠的骨代谢指标有一定改善作用，降低了AKP水平并提高了S-P水平，对SCa水平改善不明显，提示运动干预可以通过作用于瘦素来改善糖尿病大鼠的骨代谢水平，对改善骨质疏松有一定作用，但作用不显著。国外有研究报道证实，二甲双胍能够使多囊卵巢综合症患者的瘦素水平降低［15］，也有少数资料表明二甲双胍对糖尿病肥胖者、有糖尿病家族史的单纯性肥胖者的瘦素水平有改善的作用［16－17］。李雨［18］等研究证明，单纯二甲双胍药物干预对改善糖尿病大鼠瘦素水平效果不明显(P＞0.05)，二甲双胍联合运动干预能有效降低糖尿病大鼠骨骼肌瘦素水平(P＜0.05)、缓解瘦素抵抗。本研究结果显示，DTG组大鼠比DCG组大鼠骨髓瘦素水平显著降低(P＜0.05)，瘦素受体水平有上升趋势，但差异不显著(P＞0.05)，ETDTG组大鼠比DCG组瘦素水平显著降低，瘦素受体水平显著升高(P＜0.01，P＜0.05)。经过运动联和药物联合干预的糖尿病治疗组，其瘦素受体的表达量较单纯运动治疗组和单纯药物治疗组要显著升高，有显著性差异，可能原因为长期的有氧耐力运动联合药物使机体脂肪含量明显减少，使血浆中瘦素水平降低，在骨髓中的沉积减少，也使骨髓中自分泌的瘦素量减少，缓解了由于骨髓高瘦素血症而对瘦素受体水平的抑制作用，增加了瘦素受体的表达量，缓解了骨髓的瘦素抵抗现象。综上所述，药物联合运动双重因素对糖尿病大鼠骨髓瘦素水平的改善作用要好于单纯运动或单纯药物对其的作用效果。

4 结论

高脂膳食结合小剂量STZ诱导的2型糖尿病大鼠出现糖代谢、血清骨代谢异常，以及骨髓细胞瘦素抵抗，6周单纯的游泳训练和二甲双胍联合干预可有效缓解2型糖尿病大鼠的胰岛素抵抗、血清骨代谢异常及骨髓瘦素抵抗，其效果优于运动或药物单一干预。

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