白芷饮片中总香豆素与欧前胡素、异欧前胡素的含量测定

谢茹胜，叶燕珠，潘爱萍，吴水华

白芷饮片中总香豆素与欧前胡素、异欧前胡素的含量测定

*谢茹胜1，叶燕珠2，潘爱萍1，吴水华1

(1.福建生物工程职业技术学院，福建，福州 350002；2.福建教育学院，福建，福州 350002)

通过测定白芷传统饮片中总香豆素、欧前胡素、异欧前胡素的含量，了解其在治疗白癜风中的作用和用量。采用紫外-可见分光光度法测定白芷总香豆素的含量，采用高效液相色谱法同时测定欧前胡素、异欧前胡素含量，XB-C18分析柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相组成为甲醇和水(70:30)，流速1 mL·min-1，检测波长300 nm，流速1.0 mL·min-1。欧前胡素、异欧前胡素在范围内线性良好。本法简便、快速、准确，可用于白芷中欧前胡素与异欧前胡素的含量测定，为白芷在治疗白癜风中的作用和用量提供参考依据。

白芷；欧前胡素；异欧前胡素；含量测定

白芷为伞形科植物白芷或杭白芷的干燥根。白芷及其提取物在中医药、日化、烟草等行业广泛应用。现代药理研究证实白芷具有抗炎、解热、镇痛、平喘、降低动脉压力、具有较强的生理活性，能抑制银屑病和治疗白癜风，具有拮抗副交感神经的作用等[1-2]。白癜风是一种后天性色素脱失皮肤病，黑素细胞破坏是其基本病理改变[3]。黑色素的减少是因为酪氨酸酶活性减弱, 如果使用上调酪氨酸酶活性药物，可以提高治疗白癜风的疗效[4]。实验研究表明，白芷中含欧前胡素、异欧前胡素，花椒毒素酯等呋喃香豆素类物质[5]，这些物质具有较强的光敏作用，能激活酪氨酸酶的活性，刺激黑素细胞增强合成黑素的能力，从而可以治疗白癜风。

为了研究白芷中香豆素、欧前胡素、异欧前胡素的含量，本研究采用了索氏提取[6]提取了白芷中的香豆素。目前很多研究者采用甲醇作为提取溶剂[6-7]。而通过现代药理研究白芷提取的香豆素广泛用于中医药[8-9]，考虑到甲醇的毒性，笔者改用了乙醇作为提取溶剂。用乙醇作为溶剂提取白芷中总香豆素和欧前胡素、异欧前胡素的含量测定鲜见报道，在欧前胡素、异欧前胡素的含量测定中，进行了系统适用性试验，调整了流动相比例，不仅能同时测定欧前胡素、异欧前胡素的含量，而且测定分析时间大大缩短，提高了测定分析的工作效率，为今后测试白芷中欧前胡素和异欧前胡素提供了参考。

1 仪器与试药

1.1 药物与试剂

传统白芷饮片（产地：安徽）、欧前胡素(批号：130311，纯度≥ 98%)和异欧前胡素对照品(批号：130328，纯度≥ 98%)均购于天津一方科技有限公司，试剂乙醇为分析纯，甲醇为色谱纯。

1.2 仪器

紫外-可见分光光度计（UV-1800PC-DS2），高效液相色谱系统（岛津LC-10A）；VWD检测器；AB265-S电子天平(METTLER TOLEDO)；超声波清洗器（型号KQ-500B ，巩义市予华仪器厂）。

2 方法与结果

2.1 总香豆素的测定

本研究用紫外-可见分光光度法测定了用乙醇作为提取溶剂的白芷中总香豆素的含量[10]。白芷主要含有欧前胡素、异欧前胡素、花椒毒酚、佛手柑内酯、氧化前胡素等香豆素。根据吸光度随欧前胡素浓度变化的标准曲线，可以看出欧前胡素对照品溶液浓度在范围内，吸光度与浓度的线性关系良好，因此可以测定样品在300 nm处的紫外吸收值即可通过该标准曲线计算得到以欧前胡素表示的总香豆素含量。

2.1.1 检测波长的选择

由于香豆素成分结构的差异，导致样品的紫外吸收峰型很不规则。通过考察欧前胡素、异欧前胡素在300 nm附近有紫外吸收峰，如图1。白芷提取液在300 nm处均有较强的吸收，而且峰型变化平缓，便于定量测定。故本研究采用300 nm作为测定波长。

图1 欧前胡素对照品及总香豆素提取液紫外光谱图

2.1.2对照品的制备

精密称取欧前胡素对照品1.82 mg，置50 mL量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得。

2.1.3 供试品溶液的制备

精密称取白芷样品粉末约5 g，精密称定，置索氏提取器中，加95 %乙醇200 mL，加热回流4 h，提取液浓缩至适量，取出置50 mL量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.4 线性范围考察

分别移取上述对照品溶液1，2，3，4，5 mL于10 mL量瓶，加乙醇至刻度，分别摇匀即得系列对照品溶液，在300 nm处分别测定吸光度。以吸光度为纵坐标，溶度为横坐标，绘制标准曲线如图1，得线性回归方程为= 0.0572x（R2= 0.9995），线性范围为1.98 ~9.90 μg/mL。

取供试品溶液稀释适量，测其吸光度，根据稀释的倍数和上述线性方程y = 0.0572x 计算得到传统白芷饮片中总香豆素的含量为0.635%。

图2 吸光度随欧前胡素浓度的变化

Fig.2 Standard curve of concentration-absorption of imperatorin

2.2 欧前胡素、异欧前胡素的含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：XB-C18分析柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇一水(70:30)，等浓度洗脱，流速：1 mL/min-1。检测波长：300 nm。在此条件下，欧前胡素、异欧前胡素与白芷饮片中其他成分能达到基线分离（R﹥1.5），理论塔板数按欧前胡素峰计算不低于3000。对照品及供试品色谱图见图3和图4。

（1.欧前胡素 2.异欧前胡素）

（1.欧前胡素 2.异欧前胡素）

2.2.2 欧前胡素、异欧前胡素对照品的配制

分别称取欧前胡素、异欧前胡素对照品1 mg，精密称定，配制成50 mL量瓶中，以乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得贮备液。

2.2.3 线性范围的考察

分别配制欧前胡素、异欧前胡素系列标准溶液。分别精密吸取20 μL，注入高效液相色谱仪，记录峰面积，以对照品溶度对横坐标，峰面积（A）积分值为纵坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程。结果见图5和图6。欧前胡素线性范围为1.98~9.90 μg/mL，线性范围为1.13 ~11.3 μg/mL。结果表明，欧前胡素、异欧前胡素在线性范围内线性关系良好。

图5 欧前胡素峰面积随浓度的变化曲线

图6 异欧前胡素对照品及总香豆素提取液紫外光谱图

2.2.4 精密度试验

按上述色谱条件，以欧前胡素、异欧前胡素对照品连续进样5次，以峰面积计算，欧前胡素的RSD = 0.9%，异欧前胡素的RSD = 0.7%。

2.2.5 样品含量测定

取2.1.3项下超声提取供试液经滤膜过滤，精密吸取20 μL，注入高效液相色谱仪，重复进样3次，测定峰面积，根据2.2.2项下标准曲线分别计算出白芷样品中欧前胡素、异欧前胡素平均含量分别为0.092%、0.094%。

2.2.6 稳定性试验

取2.2.5项下供试品溶液，在室温下放置，按上述色谱条件，分别在1、3、5、7、9 h 测定，以峰面积计算，欧前胡素的RSD = 0.5%，异欧前胡素的RSD = 0.6%，表明供试品溶液在9 h 内稳定。

3 结论

笔者通过调查了解到漳州龙海地区民间治疗白癜风的中药材主要有复方中药白芷等其他成分，取5 g研磨打成粗粒，加入煤油中浸泡，每天用棉签涂药液于患处，每日数次，连续涂4 d左右，白斑皮肤开始变红后渐黑，一周后灶部位皮肤（即黑色部分）可以剥离一薄层皮肤，两周后灶部位皮肤可恢复正常肤色。尽管疗效显著，但是其作用机理不明确，存在溶出差、粘着性差及使用不方便等问题。

根据2010版《中国药典》白芷[11]项下欧前胡素的含量测定方法，同时测定欧前胡素、异欧前胡素的含量，进行了系统适用性试验，调整了流动相比例，由原来甲醇与水的比例由55:45调整为70:30。能同时测定欧前胡素、异欧前胡素的含量，而且测定分析时间从原来1 h缩短至12 min，提高了测定分析的工作效率。

笔者结合文献并实验研究了白芷的主要活性成分。本研究采用了索氏提取白芷中的香豆素，考虑到白芷提取的香豆素广泛用于中医药，关系人类健康，笔者改用了乙醇作为提取溶剂，用紫外-可见分光光度法测定了白芷中总香豆素的含量为0.533%。并采用HPLC同时测定欧前胡素、异欧前胡素含量分别为0.092%、0.094%。尽管用乙醇作为白芷中的提取溶剂时，总香豆素包括欧前胡素、异欧前胡素的含量比用甲醇作为溶剂时有所降低，但使用更安全。其成分和含量分析可以为今后在治疗白癜风中白芷的主要作用成分和白芷复方软膏制剂用量或者规格的选择提供参考依据。

[1] 吴媛媛,蒋桂华,马逾英,等.白芷的药理作用研究进展[J].时珍国医国药,2009,20(3):625-627.

[2] 温慧萍.白芷的性味归经与药理作用的相关性[J].国际中医中药杂志,2012,5:459-461.

[3] 韩玲.白癜风及其中医药治疗研究进展[J].中药药理与临床,2006,22(6):77-80.

[4] 侯俊芝,王建锋.中医药治疗白癜风研究进展[J].中国西医结合皮肤性病学杂志,2012,1l(4):264-265.

[5] 胡华杰,楼招欢,吕圭源,等.HPLC测定不同产地白异欧前胡素的含量[J].浙江中医药大学学报,20l0,34(3): 418-420.

[6] 毛志青.HPLC法测定白芷中4个香豆素类成分的含量[J].中国药师,2011,14(2): 205-207.

[7] 张利.白芷新型饮片中总香豆素与欧前胡素的含量测定[J].时珍国医国药, 2011,22(1):80-81.

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[10] 马逾英，钟世红.紫外-可见分光光度法测定川白芷中总香豆素类成分的含量[J].华西药学杂志,2005，20(2):159.

[11] 国家药典委员会.中国药典(Ⅰ部)[M].北京:化学工业出版社,2010:98.

CONTENT DETERMINATION OF TOTAL COUMARINS, IMPERATORIN AND ISOIMPERATORIN IN ANGELICAE DAHURICAE DECOCTION PIECES

*XIE Ru-sheng1, YE Yan-zhu2, PAN Ai-ping1, WU Shui-hua1

(1. Fujian Vocational College of Bioengineering, Fuzhou, Fujian 350002, China; 2. Fujian Institute of Education, Fuzhou, Fujian 350002, China)

：To understand the role and dosage in the treatment of vitiligo by determining the contents of total coumarins, imperatofin and isoimperatorin in Angelicae Dahuricae decoction pieces.: The content of coumarins was measured by UV-VIS spectrophotometry, the contents of imperatofin and isoimperatorin were measured by HPLC with a Zorbax XB-C18 (4.6 mm × 250 mm, 5 μm) column, a mobile phase of methanol-water volume ratio as 70:30, a detection wavelength of 300 nm and a flow rate of 1 mL/min.：The results showed that imperatorin and isoimperatorin were in good linearity within certain ranges.: The method is rapid, simple and accurate for the content determination of imperatorin and isoimperatorin in Angelicae Dahuricae decoction pieces, and will provide a reference basis on the role and dosage of in the treatment of vitiligo.

Angelicae Dahuricae decoction pieces; imperatorin; isoimperatorin; determination

R282

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2014.06.019

1674-8085(2014)06-0088-04

2014-08-15；

2014-10-19

福建省教育厅A类科技项目(JA11336)

*谢茹胜(1978-)，女，福建龙海人，讲师，主要从事分析化学的研究(E-mail:xierusheng78@163.com）;

叶燕珠(1979-)，女，福建南安人，讲师，主要从事结构化学的研究(E-mail:29713222@qq.com）;

潘爱萍(1974-)，女，福建福州人，讲师，主要从事药物化学的研究(E-mail:229878284@qq.com）;

吴水华(1978-)，女，福建龙岩人，讲师，主要从事中药药物分析的研究(E-mail:47287499@qq.com）