利用基因组比对方法寻找大肠杆菌DH1基因组中的非必需序列

虞剑，黄勇，周长林，童贻刚，方宏清

1.中国药科大学 生命科学与技术学院，江苏 南京 210009；2.军事医学科学院 a.生物工程研究所；b.微生物流行病研究所；北京 100071

大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简便，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受遗传工程专家的重视。目前大肠杆菌是应用最广泛、最成功的表达体系，常作为高效表达的首选体系。在大肠杆菌基因组中，存在一些非必需序列，这些序列的删除不会对生物稳定性或基因产物造成不利影响。这些非必需序列包括插入序列元件、限制性修饰系统基因、破坏外源性DNA的核酸内切酶基因和一些鞭毛基因家族等[1]。插入序列元件的存在能够影响基因组的稳定性。鞭毛负责细菌的运动，在工业生产和实验室条件下，细菌的运动性对于细胞生产和生长来说并不是必需的，相反，这些鞭毛的存在增加了细胞的耗能，因此这些鞭毛基因也是可删除的元件。Baba等[2]于2006发表了一项关于大肠杆菌基因必需性的研究结果，涉及绝大多数的大肠杆菌基因。他们构建了大批量单个基因缺失的突变株，对这些突变株进行检测，结合遗传足迹法、大肠杆菌染色体研究数据库、系统的转座子诱变法对大肠杆菌一系列基因必需性进行判定，对每个受检测的基因给出了必需性评分，为大肠杆菌基因组研究提供了大量可参考信息。

细胞工厂，即一个可控性和可预料性更强的单元系统[3]。近年来，一些国家开始了构建细胞工厂的项目。第五次欧盟框架计划执行了细胞工厂项目，期望构建的细胞工厂能在代谢工程领域有优异的表现。日本也在2001年启动了最小化基因工厂（MGF）计划，在该计划中，一些模型微生物被遗传改造，从而获得基因组减小后的细胞，并期望构建的基因组最小化细胞能作为细胞工厂体系的理想平台，已获得一些典型的成果。如2002年，Kolisnychenko等[1]将大肠杆菌MG1655的基因组减小了8.1%，得到MDS12菌株，菌株的生长特性没有发生改变；2006年，Posfai等[4]报道，他们完全删除了大肠杆菌MG1655中的可移动元件，基因组减小率达15%，得到了MDS43菌株，其生长特性没有发生改变，同时基因组稳定性得到了提高，使得电转效率提高，并可表达一些毒素蛋白；2008年，Mizoguchi等[5]对大肠杆菌W3110进行了基因组连续删减，使基因组减小了22%，得到菌株MFG-01，菌株的生长特性并没有发生改变，同时提高了1.5倍的细胞密度，且改造后苏氨酸的产量提高了2.4倍。除了关于基因组减小菌株在生长特性、细胞密度、电转效率及产物表达能力等方面的报道外，在2005年Hashimoto[6]等发表的文章中，还提到了关于大肠杆菌基因组减小菌株在细胞形态学上的变化：基因组删减菌株的细胞长度和宽度会发生改变，对基因组较大比例的删减会使突变体细胞变得更长更宽，甚至一些表型会和球状细胞类似。这一报道或许有助于一些未知基因功能的研究。本研究的目的是通过基因组比对的方法，确定实验室常用的大肠杆菌DH1中的非必需序列，为构建基因组减小的大肠杆菌底盘细胞奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株基因组序列

大肠杆菌DH1、MG1655、W3110全基因组序列及注释来自GenBank。

1.2 大肠杆菌全基因组比对

利用软件包Lasergene中的EditSeq软件对查询到的MG1655、W3110全基因组序列进行编辑，去除文献[4-5]报道中的已敲除区域序列，将得到的基因序列 分 别 命 名 为 miniMG1655、miniW3110；通 过MAUVE软件将DH1的基因组分别与miniMG1655、miniW3110的基因组进行比对，得到DH1基因组上多出的序列区域，称为候选非必需区域。

1.3 大肠杆菌DH1基因组中非必需区域的筛选

为了避免因3株菌基因组的差异性而使必需序列被包含在候选非必需序列区域中，根据文献中对大肠杆菌基因必需性和非必需性的研究[2,7]，评价候选非必需区域中所包含基因的必需性，从而筛选出包含非必需基因的序列区域，称为大肠杆菌DH1基因组上的非必需区域。以文献中单基因突变库、遗传足迹分析、大肠杆菌染色体研究数据库、转座子突变库等对大肠杆菌基因必需性的评价结果为基础，对于同一个基因，将4种评价体系的评分相加后得到一个总评分。总评分越低，对应基因的必需程度就越小；总评分越高，对应基因的必需程度就越大。

2 结果

2.1 大肠杆菌全基因组序列

根据文献报道,从GenBank下载得到3种大肠杆菌的全基因组序列及其基因组注释（表1）。

2.2 大肠杆菌基因组比对

通过软件MAUVE对DH1与miniMG1655、miniW3110进行基因组比对，结果见图1。可以直观地看出，和miniMG1655、miniW3110相比，DH1基因组中有很多空白区，这些空白区即代表与对照基因组相比多余的序列区域。由于DH1、MG1655、W3110菌株间的同源性非常高，所以这些空白区基本都与文献报道中miniMG1655、miniW3110的已敲除区域一致。我们将这些区域整理出来，与文献中的敲除区序列进行比对分析，归纳并确定了大肠杆菌DH1中的候选非必需区域。

2.3 DH1基因组中非必需区域的确定

根据文献[2]报道中大肠杆菌基因的必需性评分，对候选非必需区域中的基因进行必需性评价分析，以其中部分基因为例进行必需性评分，结果见表2，分数越低，表明基因的非必需性越高。在对所有候选非必需区域中的基因进行评分后，保留必需基因，并整理得到了64个非必需区域，结果见表3。

3 讨论

细胞工厂作为一个全新的概念，在微生物领域渐渐崭露头角。更多的国家开始实施或计划实施细胞工厂项目，因为得到一个好的细胞工厂，例如经基因组最小化改造的大肠杆菌MFG-01[5]，其遗传的稳定性、对产物的高表达能力可以为工业化生产带来全新的飞跃式发展。

大肠杆菌是最常用、研究最多的宿主菌，但在长期进化过程中携带了大量对细胞工厂底盘不必需的序列。这些序列导致大肠杆菌的遗传不稳定，影响细胞工厂的效率及稳定性。将这些非必需序列删除，构建遗传稳定、背景干净，并具有鲁棒性（robust）代谢行为的底盘细胞，可以提高异源途径的合成效率，提高目标产物的表达水平。这些优势使得大肠杆菌成为构建细胞工厂的首选菌株。

表1 菌株编号、GI及基因组长度

图1 大肠杆菌DH1和miniMG1655（上图）、miniW3110（下图）基因组比对图

在大肠杆菌基因组减小的过程中，面临的首要问题是确定非必需序列区域。需要对基因的必需性有充分的认识，才能合理选择非必需序列区域。目前主要利用比较基因组学、功能基因组学和代谢网络计算模拟等方法初步预测、分析识别必需基因及非必需基因，并结合单基因或多基因组合敲除试验加以确证[8]。而随着新基因的不断发现，如新小分子蛋白质基因和小分子RNA基因的发现，使得非必需基因之间的区域是否都是非必需序列成为未知，所以通过非必需基因确定非必需序列区域具有一定的局限性。例如，目前在大肠杆菌中发现的小分子蛋白质扮演着多种角色，如yobF基因与菌株的耐酸能力相关[9]；blr基因可调节菌株对细胞膜压力的敏感性[9]；ykgO基因受到锌的抑制[10]，其编码的蛋白YkgO可以在锌缺失的条件下发挥核糖体功能[11]；rpmH编码的小分子蛋白与内膜蛋白的嵌入相关[12]；还有一些基因组编码的小分子蛋白质，在高浓度时表现出细胞毒性，如ShoB蛋白[13]。由于已知小分子蛋白质的功能多样性，且在大肠杆菌中还存在许多未知功能的小分子蛋白质，所以在大肠杆菌基因组改造过程中，必须考虑到编码小分子蛋白质基因对改造目的的影响。

表2 候选非必需区域中基因的必需性评价

在本研究中，由于大肠杆菌DH1、MG1655、W3110菌株基因组的同源性非常高，故参考MG1655、W3110非必需区域删减的相关文献，通过软件MAUVE进行基因组比对，得到类似的候选非必需区域，缩小了非必需区域筛选范围，然后根据大肠杆菌非必需基因的文献报道确定了DH1基因组上64个非必需区域。这为后续利用实验室成熟的Red同源重组技术[14]构建基因组最小化的底盘细胞miniDH1提供了基础。

表3 大肠杆菌DH1基因组中的非必需区域

[1]Kolisnychenko V,Plunkett G,Herring C D,et al.Engineer⁃ing a reduced Escherichia coli genome[J].Genome Res,2002,12(4):640-647.

[2]Baba T,Ara T,Hasegawa M,et al.Construction of Escherich⁃ia coli K-12 in-frame,single-gene knockout mutants:the Keio collection[J].Mol Syst Biol,2006,2:2006-2008.

[3]Mizoguchi H,Mori H,Fujio T.Escherichia coli minimum ge⁃nome factory[J].Biotechnol Appl Biochem,2007,46:157-167.

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