酸溶辅助超声波法提取类球红细菌类胡萝卜素条件优化

李祖明，张 猛，张 静，高丽萍，惠伯棣，杨卫东，王 栋，白志辉

(1.北京联合大学应用文理学院，北京 100191;2.北京天维新探生物科技有限公司，北京 100176;3.中国科学院生态环境研究中心，北京 100085)

类胡萝卜素是一类黄色、橙红色或红色的天 然色素的总称，是一种多烯类化合物。类胡萝卜素能够预防癌症，提高人体免疫力，为人体补充必需的维生素，是一种重要的抗氧化物。现有研究表明类胡萝卜素具有食品着色剂和营养增补剂的双重功效，因而被广泛应用于食品、医药、化妆品和饲料添加剂中［1-2］。目前，类胡萝卜素已成为主要的研究热点课题之一［3-4］。人们获得类胡萝卜素主要是通过化学合成、植物提取和微生物发酵途径，化学合成类胡萝卜素因毒性其应用受到限制［5］;植物提取法获得类胡萝卜素存在受季节限制、产量较低、成本较高的劣势［6］;微生物合成类胡萝卜素因其高效和易于操控而越来越受到广泛关注［7］。一些光合微生物，例如细菌、酵母和霉菌同样具有合成类胡萝卜素的能力［8-9］。类球红细菌属光合细菌，属于细菌域中紫色细菌群的A亚群，具有广泛的代谢方式，已成为一种非常有工业化开发潜力的微生物［10-11］。已有文献报道了从生物材料中提取类胡萝卜素，却鲜有从类球红细菌中提取类胡萝卜素的文献报道［4］。超声波破碎法因具有利于生理活性物质保持活性、提取速度快、工艺可行等特点，在类胡萝卜素的提取中得到应用［12］。Gu 等［4］研究表明酸溶法提取类球红细菌类胡萝卜素效果较好。本实验采用酸溶辅助超声波法提取类球红细菌类胡萝卜素，通过单因素实验和正交实验确定其最佳的提取条件，为其深入研究和产业化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)3757菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号 CGMCC NO.3757。

1.1.2 培养基 种子培养基(w/v):葡萄糖2%，蛋白胨1%，酵母提取物1%，氯化钠0.5%，pH 7.2;固体培养基(w/v):在种子培养基中添加2%琼脂;发酵培养基(w/v):苹果酸钠0.4%，葡萄糖2%，硫酸铵0.7%，酵母浸膏1%，磷酸氢二钾0.09%，磷酸二氢钾0.06%，硫酸镁0.02%，生长因子溶液1%，pH 7.0。其中生长因子溶液配方(w/v):维生素B11%，烟酰胺(VPP)1%，生物素0.0016%。生长因子过滤除菌，其余121℃灭菌15 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化 将冰箱内保存的类球红细菌3757菌株划线于固体培养基平板上，37℃活化2～3 d，挑选单菌落进一步纯化，最后再筛选出单菌落保存于斜面固体培养基上。

1.2.2 种子制备 将活化的类球红细菌3757接种于装有种子培养基的三角瓶中，于32℃，180 r/min培养24 h，得到液体种子。

1.2.3 发酵制备菌体 按照5%的接种量将液体种子接种到盛有发酵培养基的三角瓶中，于32℃，180 r/min培养40 h，得到发酵液。取发酵液于12000 r/min离心10 min，弃上清液，收集菌体，蒸馏水洗涤3次，备用。

1.2.4 研磨法 取菌体0.5 g，加适量石英砂研磨15 min，研磨成匀浆，再用10倍体积的丙酮震荡30 min。

1.2.5 超声波法 取菌体0.5 g，加入5 mL丙酮，震荡混匀后用超声波粉碎仪进行破壁处理:振幅30%、工作/间隔时间1 min/1 min，超声波总时间15 min。最后震荡30 min。

1.2.6 酸溶法 取菌体0.5 g，加入3 mL 2 mol/L盐酸，于25℃处理20 min，然后在12000 r/min离心10 min，收集菌体，再用10倍体积的丙酮震荡30 min。

1.2.7 冻融法 取菌体0.5 g，于 －20℃处理2 h后常温解冻1 h，再用10倍体积的丙酮震荡30 min。

1.2.8 酸溶辅助超声波法 先采用酸溶法处理菌体，再综合采用超声波法处理。

1.2.9 冻融辅助超声波法 先采用冻融法处理的菌体，再综合采用超声波法处理。

1.2.10 类胡萝卜素收集 采用不同提取方法提取菌体中类胡萝卜素后，于12000 r/min离心10 min，收集上清液即为类胡萝卜素提取液。

1.2.11 类胡萝卜素测定 参照Gu等［4］方法测定并计算类胡萝卜素提取率。

1.2.12 单因素实验 在酸溶辅助超声波法初始提取条件下，选择提取溶剂(丙酮、石油醚、乙酸乙酯和正丁醇)、料液比(1∶5、1∶7.5、1∶10、1∶15和1∶20)、超声波总时间(包括工作和间隔时间)(5、10、15、20 和 25 min)、超声振幅(20%、30%、40%、50%和60%)、超声工作/间隔时间(1 min/1 min、1 min/2 min、2 min/1 min、2 min/2 min 和 2 min/3 min)、酸浓度(1.0、1.5、2.0、2.5 和 3.0 mol/L)、酸溶温度(18、21、24、27 和 30 ℃)、和酸溶时间(5、10、15、20和25 min)作为单因素实验考察因素，分别考察其对类球红细菌类胡萝卜素提取率的影响。

1.2.13 正交实验 在单因素实验基础上，选择合适的因素和水平，进行正交实验，找出最优的因素和水平，得到较高的类胡萝卜素提取率。

1.2.14 重复性实验 在最佳提取工艺条件下进行重复性实验，并同优化前条件进行对比。

2 结果与分析

2.1 不同提取方法比较

分别采用超声波法、研磨法、酸溶法、冻融法、酸溶辅助超声波法和冻融辅助超声波法从类球红细菌类3757菌株中提取胡萝卜素，以最高提取率为100%，考察不同提取方法对其提取率的影响，结果见表1。可见，酸溶辅助超声波法提取类胡萝卜素的效果最好，其提取率是研磨法的1.91倍，是超声波法的1.32倍，是冻融辅助超声波法的1.08 倍。

表1 不同提取方法比较Table 1 Comparison of different extraction methods

2.2 提取溶剂的选择

在酸溶辅助超声波法初始条件下处理菌体，然后将提取剂丙酮分别用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇代替，以最高提取率为100%，考察提取溶剂对类胡萝卜素提取率的影响，结果见图1。采用不同溶剂提取类胡萝卜素，其提取效果存在明显差异，采用丙酮为提取溶剂时类胡萝卜素的提取率最高，是最低提取率的9.81倍。

图1 提取溶剂对类胡萝卜素提取率的影响Fig.1 Effect of extraction solvent on extraction rate of carotenoid

2.3 料液比

在酸溶辅助超声波法初始条件下，固定菌体量，改变料液比(菌体质量/丙酮体积)分别为1∶5、1∶7.5、1∶10、1∶15 和 1∶20，以最高提取率为100%，考察料液比对类胡萝卜素提取率的影响，结果见图2。随丙酮用量的增大，细胞浓度降低，有利于细胞破碎，这是因为细胞浓度越高，液体的黏稠度越大，不利于空化泡的形成及其膨胀和爆炸，导致破碎效果较差。但超过最适料液比1∶10后，当丙酮用量再继续增大时，破损率降低;这可能是由于丙酮用量越大，超声波在丙酮液中传递的损失也就越大，破碎效果相应也就越差［13］。可见，料液比对类胡萝卜素提取率影响显著，最适料液比为1∶10。

图2 料液比对类胡萝卜素提取率的影响Fig.2 Effect of ratio of material to liquid on extraction rate of carotenoid

2.4 超声波总时间

在酸溶辅助超声波法初始条件下，改变超声波总时间(包括工作和间隔时间)分别为5、10、15、20和25 min，以最高提取率为100%，考察超声波总时间对类胡萝卜素提取率的影响，结果见图3。随超声波总时间的增加，类胡萝卜素提取率逐渐上升，当超声波总时间为15 min时，类胡萝卜素提取率最高，是最低提取率的1.49倍;其后提取率反而降低。这主要是由于破碎时间过长延长了类胡萝卜素与氧气、光的接触时间，导致类胡萝卜素降解。并且由于作用时间过长使细胞过于粉碎，导致大量蛋白和其他杂质被提取出来，增加了后续提取分离的难度，影响产品的纯度［13］。可见，超声波总时间对类胡萝卜素提取率影响显著，最适超声波总时间为15 min。

图3 超声波总时间对类胡萝卜素提取率的影响Fig.3 Effect of total time of ultrasonic treatment on extraction rate of carotenoid

2.5 超声波振幅

在酸溶辅助超声波法初始条件下，改变超声波振幅分别为20%、30%、40%、50%和60%，以最高提取率为100%，考察超声波振幅对类胡萝卜素提取率的影响，结果见图4。可见，超声波振幅对类胡萝卜素提取率影响不显著;当超声波振幅为40%时，类胡萝卜素提取率最高，是较优振幅。

图4 超声波振幅对类胡萝卜素提取率的影响Fig.4 Effect of vibration amplitude of ultrasonic treatment on extraction rate of carotenoid

2.6 超声波工作/间隔时间

在酸溶辅助超声波法初始条件下，改变工作/间隔时间分别为1 min/1 min、1 min/2 min、2 min/1 min、2 min/2 min 和2 min/3 min，以最高提取率为100%，考察超声波工作/间隔时间对类胡萝卜素提取率的影响，结果见图5。可见，超声波工作/间隔时间对类胡萝卜素提取率的影响不显著;当工作/间隔时间为2 min/1 min时，类胡萝卜素提取率最高。超声波通过空化效应破碎细胞的过程实际就是空化泡形成、振动、膨胀、压缩和崩溃闭合的过程，该过程需要一段短暂的时间来完成，短时多次的工作方式能使超声波产生的空化泡，有足够的时间和更多机会完成膨胀和爆炸过程，因此有利于细胞的破碎［13］。

图5 超声波工作/间隔时间对类胡萝卜素提取率的影响Fig.5 Effect of work/rest time of ultrasonic treatment on extraction rate of carotenoid

2.7 酸浓度

在酸溶辅助超声波法初始条件下，改变盐酸浓度分别为1.0、1.5、2.0、2.5 和 3.0 mol/L，以最高提取率为100%，考察盐酸浓度对类胡萝卜素提取率的影响，结果见图6。随盐酸浓度逐渐增大，类胡萝卜素的提取率也不断增加，当盐酸浓度为2 mol/L时，类胡萝卜素的提取率最大。可见，酸浓度对类胡萝卜素提取率有明显影响，较优酸浓度为2 mol/L。

图6 酸浓度对类胡萝卜素提取率的影响Fig.6 Effect of concentration of HCl treatment on extraction rate of carotenoid

2.8 酸溶温度

在酸溶辅助超声波法初始条件下，改变酸溶温度分别为18、21、24、27和30℃，以最高提取率为100%，考察酸溶温度对类胡萝卜素提取率的影响，结果见图7。随酸溶温度的升高，类胡萝卜素提取率增加，当酸溶温度达到27℃时，类胡萝卜素提取率最高，其后提取率又下降。可见，酸溶温度对类胡萝卜素提取率影响不显著，最适酸溶温度为27℃。

图7 酸溶温度对类胡萝卜素提取率的影响Fig.7 Effect of temperature of HCl treatment on extraction rate of carotenoid

2.9 酸溶时间

在酸溶辅助超声波法初始条件下，改变酸溶时间度分别为5、10、15、20 和 25 min，以最高提取率为100%，考察酸溶时间对类胡萝卜素提取率的影响，结果见图8。随酸溶时间的延长，类胡萝卜素提取率增加，当酸溶时间为15 min时，提取率最高。可见，酸溶时间对类胡萝卜素提取率有明显影响，较优酸溶时间为15 min。

图8 酸溶时间对类胡萝卜素提取率的影响Fig.8 Effect of time of HCl treatment on extraction rate of carotenoid

2.10 正交实验

单因素试验发现，超声波总时间、料液比、酸浓度和酸溶时间对类胡萝卜素提取率的影响较显著。而超声波振幅、超声波工作/间隔时间、酸溶温度对类胡萝卜素提取率的影响不显著。故选择料液比、超声波总时间、酸浓度和酸溶时间进行四因素三水平正交实验，实验设计见表2，实验结果和分析见表3和表4。

表2 正交试验因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal test

表3 正交实验结果与分析Table 3 Results and analysis of orthogonal test

由表3极差分析可知，各因素对类球红细菌中类胡萝卜素提取率的影响从大到小依次为料液比、超声波总时间、酸浓度和酸溶时间。各因素的最佳组合为A2B3C3D3，即料液比为1∶10，超声波处理总时间为20 min，酸浓度为3 mol/L，酸溶时间为25 min。方差分析结果(表4)表明，料液比对类球红细菌类胡萝卜素的提取率有显著影响(P＜0.05)，而超声波总时间、酸浓度和酸溶时间对类胡萝卜素的提取率无显著影响。

表4 正交试验的方差分析Table 4 Variance analysis of factors in the orthogonal test

综合单因素和正交实验结果，得到酸溶辅助超声波法提取类球红细菌类胡萝卜素的最佳提取工艺条件:料液比1∶10、超声总时间20 min、酸浓度3 mol/L、酸溶时间25 min、超声波振幅40%、超声工作/间隔时间2 min/1 min、酸溶温度27℃，提取溶剂为丙酮。

2.11 重复性实验

在最佳提取工艺条件下做5组重复试验，结果见表5。可见，在最优提取工艺条件下，相对标准偏差(RSD)为0.72%，试验的重现性较好，平均提取率为1293.1 μg/g，优化前超声波法初始条件类胡萝卜素提取率为739.8 μg/g。可见，优化后提取率比优化前提高了74.8%。

表5 重复性实验Table 5 Duplicated test under optimized extraction conditions

3 讨论

采用单因素和正交试验对类球红细菌3757产类胡萝卜素的提取条件进行了优化，结果表明:①采用超声波法、酸溶法、研磨法、冻融法、酸溶辅助超声波法和冻融辅助超声波法从类球红细菌3757菌株中提取类胡萝卜素，发现酸溶辅助超声波法是较优的提取方法;②通过单因素和正交实验，得到了酸溶辅助超声波法的最佳提取工艺条件为料液比1∶10、超声波处理总时间20 min、酸浓度3 mol/L、酸溶时间25 min、超声波振幅40%、超声工作/间隔时间2 min/1 min、酸溶温度27℃，提取溶剂为丙酮;③实验结果重现较好。优化前超声波法初始条件的类胡萝卜素提取率为739.8 μg/g，酸溶辅助超声波法优化后条件的提取率为1293.1 μg/g;优化后提取率比优化前提高了74.8%。这有利于后续类球红细菌类胡萝卜素的分离纯化和结构分析，为其后性质和功能研究以及产业化生产提供了科学依据。

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