中华剑角蝗共生真菌Penicillium oxalicum中苯并吡喃酮二聚体类化合物的研究

徐 帮，邹 坤，郭玲芝，刘呈雄，程 凡

三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室，宜昌 443002

昆虫是生物界种类数量最多的类群，约占全球生物多样性的一半。昆虫与微生物的共生是一种普遍的现象，其种类之多、数量之大及分布之广则意味着昆虫共生菌有丰富的多样性，源自其中的共生真菌可能会产生结构新颖，类型丰富的活性次级代谢产物，因而昆虫共生真菌已成为寻找新生物活性物质的新的重要来源［1］。但目前，人们对昆虫共生菌研究的很少，对其代谢产物研究更少。

本文作者从中华剑角蝗的肠道中分离得到一株草酸青霉(Penicillium oxalicum)菌株，对其发酵产物进行了化学研究，从中分离得到6个化合物，通过波谱数据分析及理化性质鉴定了它们的结构，确定为苯并吡喃酮二聚体类化合物，所有化合物均为首次从该属菌种中分离得到。采用MTT法进行了细胞毒活性的测试，结果发现化合物1对人体肝癌细胞Hep G2具有显著的细胞毒活性，其IC50值为1.1 μM。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Bruker AV 400核磁共振波谱仪，瑞士布鲁克公司;AmozonSL+1200液相色谱-双重漏斗传输离子阱质谱仪，德国布鲁克·道尔顿公司;Dionex Ultimate 3000型高效液相色谱仪，美国戴安公司;Cosmosil MS-II RP-C18色谱柱(5 μm，250 ×10 mm 半制备型;5 μm，250×4.6 mm 分析型);低温冷冻干燥机，美国Labconco公司;WZZ-2S数字式自动旋光仪，上海精科;薄层色谱硅胶GF254，青岛海洋化工有限公司;正相色谱硅胶，烟台化学工业研究所;反相色谱硅胶，日本 YMC公司;Sephadex LH-20，美国Pharmacia公司;除了分析和制备用的色谱纯乙腈外，其它试剂均为分析纯。

1.2 菌株和细胞株

实验菌株分离自中华剑角蝗肠道，昆虫样品于2011年7月采集于湖北省神农架大九湖国家湿地公园，菌株由三峡大学涂璇博士鉴定为草酸青霉(Penicillium oxalicum)，保存于三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室;人肝癌细胞Hep G2购自武汉大学中国典型培养物保藏中心，由三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室传代保藏。

1.3 培养基

培养基:SDA培养基(葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，琼脂20 g，水1000 mL，pH值自然);SD培养基(葡萄糖40 g，蛋白胨 10 g，水 1000 mL，pH 值自然)，1.25×105Pa灭菌20 min。

1.4 菌株Penicillium oxalicum的发酵

菌株经SDA培养基斜面活化后，接种于SD种子培养基中，于28℃、125 rpm振荡培养3 d;将培养好的种子以5%的接种量接种于SD发酵培养基中，于28℃、125 rpm振荡培养16 d，共发酵40 L。

1.5 细胞毒活性的测试——MTT法［2］

培养细胞按1×105个/mL的密度种植于96孔培养板中，37℃、5%CO2培养箱中培养12 h，将待测药物配制成6个浓度梯度，加入到96孔培养板中，每个浓度梯度设6个复孔，并设置空白孔(含细胞的培养液+MTT+DMSO)、阳性药物孔(含细胞的培养液+25 μg/mL丝裂霉素+MTT+DMSO)及调零孔(培养液+MTT+DMSO)。继续培养24 h、48 h、72 h后，于每孔中加入20 μL的 MTT试剂(5 mg/mL)显色，继续培养4 h，吸出孔内的培养液，于每孔中加入150 μL的DMSO，震荡摇匀10 min，使结晶物充分溶解。酶标仪490 nm波长下测其OD值，按公式计算抑制率。计算公式:生长抑制率(%)=(1-药物孔OD/空白孔OD)×100%。采用SPSS 13.0软件进行统计学处理，计算半数抑制浓度(IC50)值。

2 提取与分离

发酵液40 L过滤，用乙酸乙脂萃取滤液，减压浓缩得12.2 g粗提物;菌丝体经37℃烘干处理后，用氯仿-甲醇(1∶1)浸提烘干的菌丝体，过滤，上清液减压浓缩得10.6 g粗提物。将上述粗提物合并，经正相硅胶柱色谱(800 g正相硅胶，200～300目)分离，氯仿-甲醇(100∶0 ～50∶50%，v/v)梯度洗脱，得5个洗脱部分(Ⅰ～Ⅴ)。Ⅰ部分中的流分Fr.2析出黄色晶体化合物1(36.6 mg)。取Ⅱ部分6.3 g，经加压反相硅胶柱色谱分离，以乙腈-水(30∶70～100∶0，v/v)梯度洗脱，合并流分 Fr.23-25，经反相HPLC 制备，乙腈-水(48∶52，v/v)洗脱，得到化合物2(15.3 mg)，化合物4(5.2 mg)，化合物 5(9.4 mg)。合并流分Fr.26-29，经反相HPLC制备，乙腈-水(68∶32，v/v)洗脱，得到化合物 3(4.2 mg)，化合物6(8.6 mg)。

图1 化合物1～6的化学结构Fig.1 Structures of Compound 1-6

3 结构鉴定

化合物1 黄色针晶;ESI-MS m/z:639［M+1］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:13.78(2H，s，8，8'-OH)，11.74(2H，s，1，1'-OH)，7.45(2H，d，J=8.5Hz，H-3，3')，6.63(2H，d，J=8.5 Hz，H-4，4')，3.93(2H，d，J=11 Hz，H-5，5')，3.72(6H，s，13，13'-OCH3)，2.73(2H，dd，J=6.0，19.1 Hz，H-7a，7a')，2.41(2H，m，H-6，6')，2.31(2H，dd，J=10.5，19.2 Hz，H-7b，7b')，1.17(6H，d，J=6.6 Hz，H-11，11');13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:187.2(C-9，9')，177.5(C-8，8')，170.3(C-12，12')，159.4(C-1，1')，158.3(C-4a，4a')，140.2(C-3，3')，117.3(C-2，2')，107.5(C-4，4')，106.3(C-9a，9a')，101.7(C-8a，8a')，84.7(C-10a，10a')，77.0(C-5，5')，53.2(13，13'-OCH3)，36.3(C-7，7')，29.3(C-6，6')，18.0(C-11，11')。结合文献报道［3-5］的波谱数据，化合物1可能是secalonic acid A(SAA)或secalonic acid D(SAD)，两者不同之处在于 5、6、10a 和 5'、6'、10a'位羟基构型不同。通过测定比旋光度与文献值相比较，化合物1的比旋光度［α］-73.3°(c=0.10，氯仿)，文献中，SAD 的比旋光度［α］+88°(c=0.10，氯仿)［3，5］，SAA 的比旋光度［α］20D-75°(c=0.10，氯仿)［4］。最终鉴定化合物 1 为 secalonic acid A。

化合物2 黄色无定形粉末;ESI-MS m/z:557［M+1］+;1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)，δ:15.34(1H，s，5'-OH)，12.76(1H，s，5-OH)，10.14(1H，s，OH-8)，7.14(1H，s，H-7)，7.01(1H，s，H-6)，6.42(1H，d，J=2.3 Hz，H-7')，6.34(1H，s，H-3)，6.24(1H，d，J=2.2 Hz，H-9')，6.02(1H，s，H-3')，4.00(3H，s，6'-OCH3)，3.65(3H，s，8'-OCH3)，3.44(3H，s，10-OCH3)，2.48(3H，s，2-CH3)，2.16(3H，s，2'-CH3);13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)，δ:184.2(C-4')，182.8(C-4)，167.7(C-2')，166.6(C-2)，165.9(C-5')，164.0(C-8')，162.5(C-6')，161.5(C-8)，157.2(C-10)，156.5(C-5)，156.2(C-10b)，152.0(C-10a')，140.9(C-6a)，140.7(C-9a')，116.0(C-9)，110.8(C-3)，109.4(C-4a)，108.0(C-5a')，107.6(C-3')，105.9(C-10a)，105.6(C-7)，104.6(C-10')，104.3(C-6)，101.6(C-4a')，97.5(C-9')，95.7(C-7')，61.3(10-OCH3)，56.2(6'-OCH3)，55.3(8'-OCH3)，20.7(2'-CH3)，20.5(2-CH3)。以上数据与文献［6］报道一致，故鉴定化合物2为asperpyrones A。

化合物3 黄色无定形粉末;ESI-MS m/z:571［M+1］+;1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)，δ:13.21(1H，s，5'-OH)，12.95(1H，s，5-OH)，7.29(1H，s，H-6)，7.12(1H，s，H-7)，6.63(1H，d，J=2.2 Hz，H-9')，6.56(1H，s，H-3')，6.54(1H，s，H-3)，6.10(1H，d，J=2.2 Hz，H-7')，4.01(3H，s，10'-OCH3)，3.74(3H，s，8-OCH3)，3.59(3H，s，8'-OCH3)，3.46(3H，s，10-OCH3)，2.56(3H，s，2'-CH3)，2.48(3H，s，2-CH3);13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)，δ:182.4(C-4')，182.3(C-4)，168.2(C-2)，167.8(C-2')，161.1(C-8')，159.6(C-8)，159.3(C-10')，156.2(C-10)，156.1(C-5)，155.6(C-10b')，155.0(C-10b)，153.6(C-5')，140.2(C-6a')，139.9(C-6a)，117.4(C-9)，109.9(C-3)，109.8(C-3')，109.1(C-6')，108.4(C-4a)，107.5(C-4a')，107.3(C-10a)，105.4(C-6)，104.0(C-10a')，101.9(C-7)，96.9(C-9')，96.3(C-7')，60.9(8'-OCH3)，56.3(8-OCH3)，55.9(10'-OCH3)，55.1(10-OCH3)，19.9(CH3-2')，19.8(CH3-2)。以上数据与文献［6］报道一致，故鉴定化合物3为asperpyrones B。

化合物4 黄色无定形粉末;ESI-MS m/z:569［M+1］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3)，δ:15.24(1H，s，5-OH)，12.83(1H，s，5'-OH)，7.26(1H，s，H-10)，7.05(1H，s，H-9)，6.43(1H，d，J=2.2 Hz，H-9')，6.33(1H，s，H-3')，6.19(1H，d，J=2.2 Hz，H-7')，6.00(1H，s，H-3)，4.03(3H，s，10'-OCH3)，3.78(3H，s，8-OCH3)，3.61(3H，s，6-OCH3)，3.42(3H，s，8'-OCH3)2.48(3H，s，2'-CH3)，2.12(3H，s，2-CH3);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:184.5(C-4)，182.9(C-4')，167.4(C-2)，166.8(C-2')，162.8(C-5)，161.7(C-8')，161.6(C-10')，160.0(C-6)，156.9(C-5')，156.7(C-8)，155.1(C-10b')，150.8(C-10a)，140.8(C-6a')，140.6(C-9a)，117.1(C-7)，110.6(C-5a)，109.4(C-3')，108.6(C-4a')，108.0(C-3)，107.3(C-6')，106.0(C-9)，105.0(C-10a')，104.2(C-4a)，101.5(C-10)，97.0(C-9')，96.3(C-7')，61.2(6-OCH3)，56.1(10'-OCH3)，56.0(8-OCH3)，55.2(8'-OCH3)，20.7(2-CH3)，20.6(2'-CH3)。以上数据与文献［6］报道一致，故鉴定化合物4为asperpyrone C。

化合物5 黄色无定形粉末;ESI-MS m/z:557［M+1］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ:14.86(1H，s，5-OH)，13.48(1H，s，5'-OH)，7.30(1H，s，H-9)，7.19(1H，s，H-10)，7.11(1H，d，J=2.2 Hz，H-9')，6.50(1H，s，H-3')，6.19(1H，d，J=2.2 Hz，H-7')，6.00(1H，s，H-3)，4.03(3H，s，10'-OCH3)，3.78(3H，s，6-OCH3)，3.61(3H，s，8'-OCH3)，2.48(3H，s，2'-CH3)，2.12(3H，s，2-CH3);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:184.5(C-4)，182.7(C-4')，167.6(C-2)，166.9(C-2')，162.3(C-5)，161.7(C-8')，161.6(C-10')，160.0(C-6)，156.9(C-5')，156.7(C-8)，155.1(C-10b')，150.8(C-10a)，140.8(C-6a')，140.6(C-9a)，117.1(C-7)，110.6(C-5a)，109.4(C-3')，108.6(C-4a')，108.0(C-3)，107.3(C-6')，106.0(C-9)，105.0(C-10a')，104.2(C-4a)，101.5(C-10)，97.0(C-9')，96.3(C-7')，61.2(6-OCH3)，56.0(10'-OCH3)，55.1(8'-OCH3)，20.8(2-CH3)，20.5(2'-CH3)。化合物5与化合物4的NMR数据相比较，除了少一个甲氧基以外，其他数据几乎完全相同。以上数据与文献［7］报道一致，故鉴定化合物5为asperpyrone D。

化合物6 黄色无定形粉末;ESI-MS m/z:571［M+1］+;1H NMR(400 MHz，CDCl3)，δ:15.25(1H，s，5'-OH)，14.83(1H，s，5-OH)，7.15(1H，s，H-10)，6.97(1H，s，H-9)，6.42(1H，d，J=2.2 Hz，H-7')，6.21(1H，d，J=2.2 Hz，H-9')，6.05(1H，s，H-3)，5.98(1H，s，H-3')，4.02(3H，s，6'-OCH3)，3.79(3H，s，8-OCH3)，3.62(3H，s，8'-OCH3)，3.46(3H，s，6-OCH3)，2.42(3H，s，2-CH3)，2.12(3H，s，2'-CH3);13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:184.6(C-4')，184.4(C-4)，167.6(C-2)，167.5(C-2')，162.7(C-5')，162.0(C-5)，161.4(C-8')，161.1(C-6')，160.2(C-8)，158.6(C-6)，153.4(C-10a)，150.8(C-10a')，140.7(C-9a)，140.5(C-9a')，117.1(C-7)，111.4(C-5a)，108.6(C-5a')，107.4(C-3)，107.2(C-3')，105.2(C-10')，104.7(C-4a)，104.3(C-4a')，101.3(C-9)，101.2(C-10)，96.9(C-7')，96.5(C-9')，62.0(6-OCH3)，56.2(6'-OCH3)，55.9(8-OCH3)，55.1(8'-OCH3)，20.8(2-CH3)，20.5(2'-CH3)。以上数据与文献［8］报道一致，故鉴定化合物6为aurasperone A。

4 活性分析

采用MTT法测定化合物对人体肝癌细胞Hep G2的生长抑制作用。实验结果显示，化合物1具有显著的细胞毒活性，其IC50值为1.1 μM。

5 结语

苯并吡喃酮类化合物的单体及二聚体类广泛分布于黑曲霉和镰刀属真菌的次级代谢产物中［9-12］。根据文献报道，这类化合物对大鼠和小鼠的中枢神经系统表现出急性毒性作用［13］，并且对 Taq DNA聚合酶具有抑制作用［5］。最近研究表明很多来源于真菌次级代谢产物的苯并吡喃酮类化合物都具有一定的抗肿瘤活性，具有十分重要的研究与开发价值，其作用机制更是有待于进一步研究。

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