饲料中添加芽孢杆菌对方斑东风螺抗氧化酶活性的影响初步研究

王 茜，孙海彦，方 哲，陈 江，王春吉，王冬梅

（中国热带农业科学院热带生物技术研究所 中国热带农业科学院热带海洋生物资源利用研究中心，海南海口 571101）

方斑东风螺（Babylonia areolata）主要分布于我国东南沿海和东南亚诸国亚热带及热带沿海，其味道鲜美、营养价值高，随着规模化人工育苗和养殖技术的成功，我国东风螺养殖业发展前景良好。但目前东风螺的养殖主要采用小杂鱼为饵料，存在饵料供应不稳定、养殖水体污染及致病性细菌侵染等问题，直接制约了东风螺养殖的规模和可持续发展。

饲用微生物制剂是利用特殊工艺将对动物有益的微生物制成的活菌剂，其作用之一是能够刺激动物的免疫系统，提高其免疫力。本试验以芽孢杆菌为配合饲料微生物添加剂，研究地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌对方斑东风螺抗氧化酶活性的影响，为生产免疫功能性东风螺配合饲料提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验饲料 基础饲料配制以鱼粉、豆粕为主要的蛋白源，鱼油为主要的脂肪源，α-淀粉为饲料黏合剂，饲料组成见表1。芽孢杆菌粉由本所提供，含菌量为0.2%。以不添加芽孢杆菌的基础饲料作为对照（C组），试验组在基础饲料中分别添加0.5%的枯草芽孢杆菌粉和0.5%的地衣芽孢杆菌粉，分别编号为K组和D组。将固体原料粉碎后过80目筛，然后按照配方称取原料，用饲料混合机混合均匀。按照配方加入鱼油和水混合揉成面团状，称重记录，再按照估算的日投喂量分成小块，装入封口袋。为保证饲料成分一致，所有试验饲料一次制备，保存于-20℃，投喂前使之解冻至室温。

表1 试验饲料组成 %

1.2 饲养管理 试验于2012年12月至2013年2月在中国热带农业科学院热带生物技术研究所海洋动物实验室进行。方斑东风螺幼螺由琼海市长坡镇昌旺东风螺养殖场提供，选择同一批螺苗，暂养驯化1周，停止投喂2 d后，挑选活力好、个体规格相近，体重为（1.9±0.2）g的个体作为试验材料，随机分配至对照组和2个试验组，每组3个重复。在37 cm×25 cm×30 cm的水族箱中，铺一层60目绢布，布上铺3～4 cm的细沙，加入天然海水，采用循环水饲养。养殖期间海水盐度为33‰，pH 为 7.6，水温为（23±1.2）℃，隔天投饵一次，1 h后清除残饵，养殖60 d后取样。

1.3 样品处理与测定 每组中各随机选取3只，共9只，每只螺组织单独测定。每次取样后立即于冰上解剖分离出肝胰脏，用预冷的生理盐水清洗，再用滤纸吸干，准确称取组织重量，按重量体积比加入9倍的生理盐水制成 10%的组织匀浆，4℃、2500 r/min离心 10 min，取上清液用于酶活测定，所有样品在24 h内测定完毕。

组织匀浆粗提液蛋白质含量用考马斯亮蓝法测定。超氧化物歧化酶 （SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）活性测定采用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行。酶活力单位定义如下：

SOD活力单位：每毫克组织蛋白在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量，为一个 SOD活力单位（U）。

CAT活力单位：每毫克组织蛋白每秒钟分解1 μmol的 H2O2的量为一个活力单位（U）。

POD活力单位：在37℃条件下，每毫克组织蛋白每分钟催化产生1 μg的底物的酶量定义为一个酶活力单位（U）。

1.4 统计分析 数据均以 “平均值±标准误”表示，采用GraphPad Prism 5.0软件进行数据分析，用单因素方差分析法 （ANOVA）进行比较，P≤0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 芽孢杆菌对方斑东风螺肝胰脏中SOD活力的影响 由图1可见，C组SOD平均活力为（24.67±4.3）U/mg prot，K 组和 D 组分别为（23.38±2.05）U/mg prot和（17.05±3.22）U/mg prot。 经统计分析，K组与C组差异不显著（P＞0.05），说明饲料中添加枯草芽孢杆菌不影响方斑东风螺肝胰脏组织中SOD的活力；而D组SOD的活力相对于空白对照的C组降低了30.89%，差异极显著（P＜0.01），说明饲料中添加地衣芽孢杆菌可引起方斑东风螺肝胰脏组织中SOD的活力降低。

图1 芽孢杆菌对方斑东风螺肝胰脏中SOD活力的影响

2.2 芽孢杆菌对方斑东风螺肝胰脏中CAT活力的影响 由图2可见，C、K、D组CAT平均活力分别为（0.91±0.46）、（0.89±0.44）U/mg prot和（0.27±0.35）U/mg prot。地衣芽孢杆菌显著降低了方斑东风螺肝胰脏中CAT的活力（P＜0.05），比对照组降低了70.33%；添加枯草芽孢杆菌的K组方斑东风螺肝胰脏中CAT的活力与对照组无显著差异（P＞0.05）。说明饲料中添加枯草芽孢杆菌不影响方斑东风螺肝胰脏组织中CAT的活力，添加地衣芽孢杆菌可引起方斑东风螺肝胰脏组织中CAT的活力降低。

图2 芽孢杆菌对方斑东风螺肝胰脏中CAT活力的影响

2.3 芽孢杆菌对方斑东风螺肝胰脏中POD活力的影响 由图3可见，与SOD和CAT不同，饲料中添加枯草芽孢杆菌的K组方斑东风螺肝胰脏中 POD 的平均活力为（4.2±0.78）U/mg prot，而对照组为（3.27±0.49）U/mg prot，与对照组的活力相比提高了28.44%（P＜0.05）；添加地衣芽孢杆菌的D组方斑东风螺肝胰脏中POD的活力为（3.41±0.62）U/mg prot，与对照组相比无显著变化（P＞0.05）。说明饲料中添加枯草芽孢杆菌可引起方斑东风螺肝胰脏组织中CAT的活力升高，添加地衣芽孢杆菌不影响方斑东风螺肝胰脏组织中POD的活力。

图3 芽孢杆菌对方斑东风螺肝胰脏中POD活力的影响

3 讨论

方斑东风螺属于无脊椎动物的新腹足类，仅有非特异性免疫系统，可分为体液免疫和细胞免疫两个部分，由血细胞分泌的抗氧化酶，被认为是体液免疫的重要组成部分（Ordasd等，2000）。动物体由于呼吸爆发而产生活性氧，一方面具有杀菌功能，另一方面也会对机体自身造成伤害，而抗氧化酶在清除自由基的过程中发挥重要的作用，从而能防止机体受到氧化破坏。SOD、CAT、POD是机体分解H2O2及清除等自由基的重要酶类。已有研究表明，肝胰脏是东风螺对抗饥饿、污染等胁迫环境的重要器官，肝胰脏抗氧化酶的活性水平与免疫防御能力密切相关（薛明等，2010）。

芽孢杆菌作为微生态制剂，在养殖生产中已广泛使用，并取得了较好的效果。在鱼、虾、贝等水产动物的研究中发现，芽孢杆菌可以提高其免疫器官的抗氧化能力和免疫功能。对草鱼的研究发现，饲料中添加枯草芽孢杆菌能显著提高草鱼血清和肝胰脏中SOD和CAT的活性 （沈文英等，2011）。而在饲料中添加枯草芽孢杆菌对凡纳滨对虾血清SOD的活性无显著影响 （王玲等，2011）。本研究以芽孢杆菌作为饲料添加剂，对方斑东风螺肝胰脏组织中SOD、CAT和POD三种酶活性进行分析，结果表明，在饲料中添加0.5%的枯草芽孢杆菌添加剂，对东风螺肝胰脏组织中SOD和CAT的活性无显著影响，但能显著提高POD的活性；而饲料中添加0.5%地衣芽孢杆菌则显著降低了东风螺肝胰脏组织中SOD和CAT的活性，对POD的活性无显著影响。虽然芽孢杆菌作为饲料添加剂已被广泛应用于禽畜和水产动物的养殖，但由于养殖对象自身的特性不同，应用效果和适宜添加量也不同。根据本试验的结果，饲料中添加0.5%的枯草芽孢杆菌可提高方斑东风螺的非特异性免疫力，反之，饲料中添加0.5%的地衣芽孢杆菌可能会降低方斑东风螺的非特异性免疫力。

[1]沈文英，李卫芬，梁权，等.饲料中添加枯草芽孢杆菌对草鱼生长性能、免疫和抗氧化能力的影响[J].动物营养学报，2011，23（5）：881 ～ 886.

[2]王玲，张春晓，孙鸣，等.饲料中添加枯草芽孢杆菌（CGMCC No.3755）对凡纳滨对虾生长性能和非特异性免疫力的影响[J].饲料工业，2011，4（32）：47～51.

[3]薛明，柯才焕，王德祥，等.饥饿及恢复生长对方斑东风螺抗氧化体系的影响[J].中国水产科学，2010，2（17）：281 ～ 288.

[4]Ordas M C，Ordas A，Beloso C，et al.Immune parameters in carpet shell clams naturally infected with Perkinsus atlanticus[J].Fish&Shellfish Immunology，2000，10：597 ～ 609.■