麦饭石载体枯草芽孢杆菌饲料添加剂应用于刺参养殖的研究

温志新，孙永欣，李亚洁，都兴范

（辽宁省农业科学院大连生物技术研究所，辽宁大连 116024）

麦饭石是一种高效无毒的药物矿石，含有多种对生物生长发育有益的常量元素、微量元素以及被称作动物生长调节剂的稀土元素和微量氨基酸（王银叶等，2003）。麦饭石因具有矿化性、吸附性，现已广泛用于矿化饮用水生产，并且可以有效捕获水体中重金属和细菌（王维清等，2005；王苏新，2003）。在饲料中添加麦饭石比无机盐能更好地补充某些营养元素的不足和缺乏，从而促进鱼虾的生长发育（董志岩等，1997）。麦饭石作为载体固定益生菌扩大了麦饭石的使用范围，该方法避免了微生物在水体中悬浮流失并保证细胞酶活性不受影响，并且价格便宜且制备过程简单，现已广泛用于水质净化（张跃峰，2006）。

由于刺参摄食的特殊性，将益生菌直接添加到饲料中会造成其在水体中散失。因此，本试验利用麦饭石吸附性对枯草芽孢杆菌固定制备成麦饭石载体枯草芽孢杆菌（下称载菌麦饭石），添加到刺参饲料中，测定其对刺参生长和抗病力的影响及对刺参养殖废水氨氮和亚硝酸盐清除能力，为益生菌在刺参养殖中的应用及合理开发麦饭石资源提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 麦饭石载体枯草芽孢杆菌制备 麦饭石微粉（200目），产于辽宁阜新。饲料级枯草芽孢杆菌菌粉购自沧州华雨药业有限公司。

1.1.1 枯草芽孢杆菌菌液制备 取少量菌粉 （约1接种环）接种于枯草芽孢杆菌发酵培养基（20 g葡萄糖+15 g蛋白胨+0.5 g牛肉膏溶于1 L海水，pH 7.5）中，于摇床中培养（36 ℃、140 r/min）14 h，菌液浓度达到108个/mL。

1.1.2 菌体细胞固定和成品制备 每1 L菌液中加入250 g麦饭石微粉，室温170 r/min振荡1.5 h后静置30 min，弃上清液，沉淀于烘箱中（60℃）烘干后用粉碎机粉碎，颗粒粒度≤100目。

1.2 试验刺参 试验用刺参为大连瓦房店某大型刺参育苗场同批刺参幼体（小白点），于养殖场室内育苗池（体积为25 m3）内工厂化养殖，每天更换1/3体积海水，每周全换水一次。每天下午投喂饲料，水温在13～16℃，盐度保持在28‰ ～31‰。

1.3 试验设计

1.3.1 养殖试验 养殖试验分4个试验组，分别是对照组、枯草芽孢杆菌组、麦饭石组和载菌麦饭石组，每个试验组为一个育苗池的全部幼体（约上亿个体），养殖试验共60 d，试验结束称量体重。

1.3.2 试验饲料 分别在基础饲料中添加5%枯草芽孢杆菌、5%麦饭石、5%载菌麦饭石。各组饲料组成及营养水平见表1。

表1 各组刺参饲料组成及营养水平 %

1.3.3 攻毒试验 试验结束后，每组取30只刺参个体，用灿烂弧菌（Vibrio splendidus，本研究所保存菌种，密度≥1012个/mL）和假交替单胞菌（Pseudoalteromonas nigrifaciens，荷兰真菌生物多样性中心，菌种号：NCCB 100134，密度≥1012个/mL）混合菌液对刺参体腔注射，每天换水，少量投喂，15 d后统计存活率。

1.3.4 不同饲料添加成分对养殖废水中氨氮、亚硝酸盐的影响 于30 L刺参养殖废水中分别投入150 mg/kg枯草芽孢杆菌粉、麦饭石粉和载菌麦饭石，并设空白对照组。分别于试验0、1、3、7 d取样测定氨氮和亚硝酸盐。期间不充气，添加的剂量参考麦饭石净化海参圈的常用量。

1.3.5 水质测定方法 用奈氏试剂法测定氨氮；用重氮-偶氮比色法测定亚硝酸盐。

1.4 统计分析 采用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析，并进行Duncan’s多重比较，存活率采用X2独立性检验统计分析，P＜0.05为差异显著。

2 结果与分析

2.1 麦饭石载体枯草芽孢杆菌对刺参体重的影响 经过60 d养殖，各组刺参幼体体重如表2所示，饲料中添加枯草芽孢杆菌组刺参平均体重低于对照组，麦饭石组和载菌麦饭石组平均体重分别比对照组高18.46%和22.80%。

表2 各试验组刺参体重

2.2 攻毒试验 由表3可见，各试验组刺参存活率均高于对照组，单独使用芽孢杆菌和麦饭石并未显著提高攻毒存活率，只有载菌麦饭石组存活率较对照组提高66%（P＜0.05）。

表3 攻毒后各组刺参存活率

2.3 麦饭石载体枯草芽孢杆菌对养殖废水中氨氮的影响 经过7 d的4次测定，对照组、芽孢杆菌组和麦饭石组水体氨氮值不断上升，芽孢杆菌组始终高于对照组，麦饭石组始终低于对照组，并在第3天时差异显著（P＜0.05）；芽孢杆菌经麦饭石固定后，其对水体氨氮去除效果虽然在第1天和第3天略差于麦饭石，但仍优于对照组和芽孢杆菌组，而在第7天时，氨氮值最低，且显著低于其他各组（P＜0.05）。单独使用枯草芽孢杆菌对水体氨氮未表现出去除能力，反而造成氨氮值升高（图 1）。

图1 麦饭石载体枯草芽孢杆菌去除水体氨氮效果

2.4 麦饭石载体枯草芽孢杆菌对养殖废水中亚硝酸盐的影响 在4次测定中，麦饭石在第1天时对水体中亚硝酸盐去除效果最好，显著低于对照组（P ＜ 0.05），在第 3、7天时，载菌麦饭石对水体亚硝酸盐去除效果最佳，低于其他组，且显著低于对照组（P＜0.05）。单独使用枯草芽孢杆菌在前期会造成亚硝酸盐值升高，在第7天测定时才表现出降解能力（图2）。

图2 麦饭石载体枯草芽孢杆菌去除水体亚硝酸盐效果

3 讨论

在水产动物肠道中，枯草芽孢杆菌孢子活化后消耗大量氧气，维持肠道厌氧环境，抑制致病菌生长，并能产生抗弧菌（黄汝添等，2006）和酵母菌（谢海平，2003）等活性物质，对鱼类嗜水气单胞菌有强烈抑杀作用（潘晓艺等，2007）。此外，枯草芽孢杆菌能通过合成维生素和辅酶因子或促进酶促反应提高肠道消化酶活性（Gatesoupe，1999）。本试验中，刺参摄食添加枯草芽孢杆菌的饲料未表现出高生长率和抗病力，原因可能是刺参摄食缓慢，芽孢杆菌被摄食之前已大部分散失，从而未被刺参有效利用。这也是益生菌在水产养殖实际应用中的局限。

麦饭石作为饲料添加剂能提高水产动物增重率和成活率。董志岩等（1997）在幼鳗饲料中添加2%麦饭石，鳗鱼增重率提高7.88%，饲料报酬提高6.21%，成活率提高4.95%。赵元凤等（2001）研究报道，在鲍鱼基础饲料中添加1%麦饭石能显著提高皱纹盘鲍（Haliotis discus hannat Ino）平均增重率。在本试验的刺参饲料中添加5%麦饭石，刺参增重率提高18.46%，攻毒存活率提高20%，这是因为麦饭石富含畜禽生长所必需的铁、硒、钴等十几种微量元素，并且麦饭石可使动物血中的γ-球蛋白增加，T淋巴细胞数目增多，从而使机体的免疫能力增强（任道泉等，1998）。

由于麦饭石呈多孔性、海绵状结构，具有良好的物理吸附性能，因此可以作为细菌吸附载体，对目的微生物固定，防止有益菌在水体中散失。本试验利用麦饭石对枯草芽孢杆菌的吸附性对其固定，结果表明，该方法制备的载菌麦饭石促进刺参增重和抗病力的效果优于二者单独使用。由于二者的协同效果，不仅利用麦饭石补充了矿物质元素，还利用枯草芽孢杆菌产生胞外消化酶和抗菌物质等，因此不论在增重率和抗病力方面均优于芽孢杆菌或麦饭石单独使用。

养殖水体中氨氮和亚硝酸盐浓度是影响水产动物正常生长和水质的关键因素，在水族箱充气养殖过程中，水体氨氮含量较少，而即使日换水量达到1/3，亚硝酸盐浓度仍较高（姚雪梅等，2007）。糙海参（Holothuria scabra）长期处于较高的亚硝酸盐浓度，食欲下降，排便量减少，当亚硝酸盐浓度超过1.8 mg/L时，海参发生吐肠。解剖肠道也发现肠道壁变硬，失去弹性。虽然海参没有死亡，但明显减重（姚雪梅等，2007）。由于在实际养殖生产中，进入人工养殖系统的氮素近90%源于投入饵料（Lorenzen等，1997），因此饲料中添加吸附或降解氨氮和亚硝酸盐的物质可在源头上直接降低水质污染并提高饵料利用率。枯草芽孢杆菌能明显降低养殖水体中氨氮和亚硝酸盐浓度，改善养殖水质（Liu和 Han，2004）。但本试验中，枯草芽孢杆菌对水体氨氮和亚硝酸盐未表现出清除作用，这与骆艺文（2009）研究结果一致，原因可能与水体溶氧不足、水温较低以及水体缺乏藻类有关。此外，枯草芽孢杆菌属严格需氧微生物，大量芽孢杆菌迅速消耗氧气，导致厌氧菌增多，由于厌氧菌对氮的同化少，故产生更多的NH3（Reddy等，1996）。而亚硝酸盐是水体氨氮转化成硝酸盐的中间产物，是在亚硝化菌和氧气作用下完成的，亚硝酸盐最终经过硝化细菌作用转变为硝酸盐，但硝化细菌繁殖速度很慢，大约20 h一代，因此水体中亚硝酸盐易升高（杨铿等，2008）。本试验芽孢杆菌组亚硝酸盐浓度前期高于对照组，之后才降低，分析可能是受到水体氨氮和溶氧的双重影响，随着氨氮浓度升高，水体溶氧快速被异养菌利用，接着被大量转化成亚硝酸盐。因此，亚硝酸盐浓度持续上升。最后，芽孢杆菌组氨氮值异常升高，而亚硝酸盐有所降低，很可能是溶氧不足，导致亚硝酸盐又转变成氨氮（Keller等，2002）。因此，使用芽孢杆菌时必须保证充足的溶氧。

本试验中麦饭石对水质净化作用较为明显，短期（3 d和1 d）对水体中氨氮和亚硝酸盐去除效果迅速，这与其显著的吸附性能有关 （石玉臣等，2000）。而载菌麦饭石对水质的净化作用为长期对水体氨氮（7 d）和亚硝酸盐（3 d后）的清除能力表现出较佳的效果，这与张跃峰（2006）试验结果一致，分析认为是枯草芽孢杆菌发挥了作用。麦饭石本身携带有大量氧气，并且能吸附水体中氨氮和亚硝酸盐，而枯草芽孢杆菌在有麦饭石提供的氧气存在时，发挥较好的氨氮和亚硝酸盐分解能力，因此在本试验中后期表现出比麦饭石更好的水质改善作用。

4 结论

枯草芽孢杆菌经过麦饭石固定后，作为饲料添加剂按5%添加能明显提高刺参幼体生长性能和抗病力，所添加成分可在3～7 d显著降低水体中的氨氮和亚硝酸盐浓度，从而降低饲料给养殖水体带来的环境压力。

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