废弃烟沫堆置发酵有机肥腐熟菌种的分离、筛选和鉴定

王明旭 江维维 刘艳霞 迟荪琳 石俊雄 李想

摘要 [目的]为加速烟草废弃物的资源化利用，筛选适合废弃烟沫快速发酵腐熟的微生物菌种成为资源化利用的重要一环。[方法]利用纤维素刚果红选择性培养基，分别从废弃烟丝、腐熟牛粪、油枯有机肥和味精下脚料等田固体废弃物中分离筛选腐熟菌种，并进行复筛、纯化和鉴定。[结果]共筛得16株腐熟菌株，其中复筛出6株高效菌株分别为F1、F2、F3、N1、N2、W1。经16S rDNA和Biolog鉴定，该6种菌菌株分别为Bacillus subtillis，Bacillus subtillis，Bacillus amyloliquefaciens，Bacillus amyloliquefaciens，Mycobacterium vaccae，Bacillis amyloliquefaciens;纤维素分解能力试验结果表明，6种降解菌对烟沫中纤维素的降解能力为N1>F3>N2>F2>F1>W1;在烟碱浓度为低浓度0.1%时耐烟碱能力为F2>F3=N1>W1>F1>N2，在烟碱浓度为高浓度0.5%时耐烟碱能力为F2>F3>N1>N2>W1=F1，同时N1与N2、N1与F1、N1与F2之间没有拮抗作用。[结论]N1与N2复配构成废弃烟沫专用腐熟菌种为最佳选择。

关键词 烟沫废弃物;腐熟菌种;纤维素降解菌;烟碱;16S rDNA;Biolog

中图分类号 S182 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）33-11686-05

Isolation， Screening and Identification of Decompositing Microorganisms for Tobacco Scrap Solid-state Fermentation

WANG Ming-xu1， JIANG Wei-wei1， LIU Yan-xia2， LI Xiang2* et al

（1. Renhuai Tobacco Filiale， Renhuai， Guizhou 564500; 2. Guizhou Academy of Tobacco Science， Guiyang， Guizhou 550081）

Abstract [Objective]In order to accelerate the decomposition of solid organic wastes of tobacco， the screening of composting microorganism plays a key role in tobacco scrap rapid process fermentation. [Method]Decomposing strains from tobacco crap， dairy manure， rapeseed meal and monosodium glutamate waste samples were screened， purified and identified by Congo red screening medium in this experiment. [Result]Six dominant strains of sixteen strains，named as F1，F2，F3，N1，N2 and W1 were isolated and identified as Bacillus subtillis，Bacillus subtillis，Bacillus amyloliquefaciens，Bacillus amyloliquefaciens，Stenotrophomonas maltophilia，Bacillis amyloliquefaciens by 16S rDNA sequence homologies and Biolog Identification. The results showed that the ability of cellulose decomposition of strains were N1>F3>N2>F2>F1>W1. Besides， the tolerances to 0.1% nicotine of 6 strains were F2>F3=N1>W1>F1>N2， while to 0.5 % nicotine were F2>F3>N1>N2>W1=F1. There was no antagonistic effect between N1 and N2， N1 and F1， and N1 and F2. [Conclusion] The combination of N1 and N2 was considered as the best complex decompositing strains for tobacco srap solid-state fermentation.

Key words Tobacco scrap; Decomposing microorganisms; Cellulose decomposition strain; Nicotine; 16S rDNA; Biolog

基金項目 国家自然科学基金《贵州省青枯病导病与抑病型土壤微生物网络差异研究》项目（41461068）;公益性行业（农业）科研专项201103004;贵州省科学技术基金项目黔科合J字[2013]2197、2198;中国烟草总公司贵州省公司科技项目《酒糟快速腐熟生产有机肥技术研究及在烤烟生产上的应用》（201410）。

作者简介 王明旭（1970- ），男，贵州绥阳人，助理农艺师，从事烟草生产与管理方面的研究。*通讯作者，助理研究员，博士，从事植物营养与土壤微生物等方面的研究。

收稿日期 2014-10-20

我国烟草的种植面积和产量均居世界首位，目前国内外烟草主要用作卷烟。作为烟草生产大国，我国烟草种植面积约130万hm2，年产量450万～500万t。在卷烟加工生产中会产生大量的烟叶、烟沫等下脚料废弃物。我国烟草废弃物的年总量在90万～100万t，约占总产量的25%[1]，其中大部分被废弃，不仅造成资源浪费，而且严重污染环境。

煙沫废弃物指除去具有烘烤价值叶片以外的烟草茎株部分，包括烟茎、烟根、土脚叶、“优化结构”政策优化掉的叶片、烟花、烟种、腋芽[2]。烟草体内已检测出的化学物超过1 000多类，主要包括各种烃、芳香烃、醛、酮、甾醇、醇、醌、酯、生物碱、色素、类异戊二烯衍生物、氨基酸和蛋白类等十几大类物质[3]。经进一步细分，鉴定出包括植物碱、有机酸、蛋白质、淀粉、甘油三脂、糖类、单宁、果胶、纤维素等3 000多种化合物，其中多数化合物是光合作用的产物，具有很高的使用价值[4]。

对废弃烟叶的综合利用，一直受到国内外研究者的重视。有很多的研究报道，如从废弃烟叶中提取烟碱，生产烟碱农药，提取茄尼醇用于生产辅酶Q10等药物[5];从未成熟的鲜烟叶中提取类似大豆蛋白质的烟草蛋白质，作为优质饲料的添加剂[6]等。但是，尚有大量的烟草废弃物未得到很好的利用。烟草废弃物中有很强植物毒性的烟碱存在，所以虽然含有丰富的有机质，但不能作为有机肥直接施于土壤，而单独堆肥腐熟耗时较长，烟碱降解效果差，且会造成环境污染和资源浪费，而且可能导致滋生病虫害的传播。目前国内常通过添加大量的植物秸秆于烟草废弃物中，以稀释降解不彻底的烟碱对农作物带来的负面影响，使烟草废弃物成为很好的有机肥源[7]。

高附加值的农业废弃物的肥料化利用，特别是高附加值的生物有机肥及有机无机复合肥的开发，不但能解决环境污染问题，而且可以为农业生产提供大量的有机肥料。这是减少农业面源污染、节约资源发展可持续农业和循环经济的重要途径[8]。在农业废弃物高附加值肥料利用过程中，加快升温速度、缩短堆腐时间是有机肥生产经济效益的关键，而接种菌剂是加快堆肥升温、促进发酵腐熟过程的措施[9-10]。竹江良等[11]研究了配备不同比例猪粪对烟草废弃物高温堆肥腐熟进程的影响，发现在烟草废弃物中加入猪粪能缩短进入高温分解阶段的时间，延长高温分解持续时间，增加全氮含量，加快物料NH2-N转化和C/N 比降低的速率，缩短堆肥腐熟时间。该课题主要是筛选出能够使烟沫废弃物高效腐熟的微生物菌种，使得烟沫废弃物能够资源化利用，不仅能够解决烤烟区的环境问题，而且能够为烟农带来更多的收入。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1

分离样品。堆肥后期（10 d）的废弃烟沫、牛粪有机肥、油枯有机肥、味精下脚料等样品用于腐熟菌种的分离、筛选，并用筛选到的菌种验证纤维素降解能力。

1.1.2

培养基及配方。纤维素降解菌富集培养基：NaNO3 0.5 g，KCl 0.5 g，K2HPO4 1.0 g，FeSO4·7H2O 痕量，MgSO4·7H2O 0.5 g，滤纸条，蒸馏水1 000 ml。滤纸条用浓度1%稀醋酸浸泡24 h，再用浓度2%苏打水冲洗至中性，灭菌后备用。

纤维素降解菌筛选培养基：CMC-Na 5.0 g，KH2PO4 1.0 g，尿素 0.5 g，（NH4）2SO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 7.5 mg，MnSO4·H2O 2.5 mg，ZnSO4·7H2O 3.6 mg，CoCl2·6H2O 3.7 mg，CaCl2 0.5 g，0.02%刚果红，16 g琼脂，去离子水定容至1 L。

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，固体加琼脂 16 g，用于细菌的分离、培养。

PDA培养基：马铃薯（去皮） 200 g，蔗糖（或葡萄糖） 20 g，固体加琼脂16 g，用于真菌的分离、培养。

高氏一号合成培养基：可溶性淀粉 20.0 g，KNO3 1.0 g，K2HPO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，固体加琼脂16 g，用于放线菌的分离、培养。

1.2 试验方法

1.2.1

纤维素降解菌的分离与筛选。

1.2.1.1

富集。称取10 g混合均匀的样品，加入90 ml无菌水中，振荡，制成悬浊液，静置约5 min后取上清液2 ml到5 ml灭菌的富集培养基中，将处理过的滤纸条放入富集培养基中，并将试管置于摇床中，170 r/min，37 ℃培养，待滤纸崩解后取2 ml转接至新鲜的富集培养基内，连续富集3次。

1.2.1.2

初筛。吸取连续富集3次的富集液0.5 ml，梯度稀释后，选择10-4、10-5和10-6 3个梯度，分别吸取0.1 ml涂布于筛选培养基，30 ℃培养，待出现明显菌落后用1 mol/L NaCl倒入培养基中处理10～15 min，选择有透明圈的菌株，将细菌转接到牛肉膏蛋白胨培养基上，放线菌转接到高氏一号培养基上，并且划线纯化，镜检没有杂菌后，用浓度15%甘油-20 ℃保存。将长出的真菌菌落在PDA培养基上单孢分离纯化3次后，制备真菌孢子悬液后，同样用浓度15%甘油-20 ℃保存。

1.2.1.3

复筛。将4 ℃保存的菌体接种到筛选培养基，30 ℃培养72 h后测定菌落与透明圈的大小。

1.2.2

细菌的鉴定。

1.2.2.1

分子生物学鉴定。将纯菌落接种到4.5 ml牛肉膏蛋白胨培养基上培养，170 r/min，30 ℃摇床培养24 h，12 000×g离心30 s后收集菌体，进行基因组DNA的提取。基因组DNA的提取使用Axygen菌体DNA提取试剂盒完成，具体步骤参照说明书。

细菌16S rRNA基因扩增以具体各自的基因组DNA为模板，使用16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增[12]。

16S rRNA基因扩增的引物为27F和1541R。 PCR反应体系：

Premix TaqVersion 2.0 25 μl，

模板DNA 1 μl，

引物1 1 μl，

引物2 1 μl，

dH2O 22 μl。

PCR反應条件：

95 ℃， 5 min;

95 ℃， 30 s;

58 ℃， 30 s 32周期;

72 ℃， 1 min;

72 ℃， 10 min;

4 ℃， ∞。

1.2.2.2

Biolog鉴定。将获得的纯培养菌种划线接种至羊血培养基，30 ℃培养转化菌种12～16 h;用Inoculatorz棉签从琼脂平板中有细胞生长的地方沾取直径3 mm的菌落接种于接种液A中调好浊度;将菌悬液倒入V型加样水槽中，使用8道移液枪将接种液接于GenⅢ板上;将GenⅢ板放于Biolog系统中，30 ℃培养24 h。

1.2.3

细菌生长曲线的测定。取纯化3～5代后的菌种，活化在平板上后接入30 ml液体培养基中，30 ℃、170 r/min培养24 h，作为种子液;以1%的接种量接入装有200 ml牛肉膏蛋白胨培养基的1 L三角瓶中，在微生物摇床中30 ℃、170 r/min培养48～72 h，每隔2 h取样1次，用分光光度计在波长600 nm的条件下测量吸光度。以时间为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制生长曲线[13]。

1.2.4

菌种分解纤维素能力大小的测定。将纯化的菌种点接到以纤维素为唯一碳源的刚果红筛选培养基中央，30 ℃培养箱培养72 h后，用1 mol/L NaCl处理，测量透明圈的大小。

1.2.5

菌种的耐烟碱程度检验。根据废弃烟沫中的烟碱含量，设置烟碱浓度为0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，每个梯度设置3个重复，将不同浓度梯度烟碱加入装有30 ml培养基的100 ml三角瓶中。将待测菌种的种子液以1%的接种量接入培养基中，30 ℃、170 r/min培养24 h后用紫外分光光度计以波长600 nm测量OD值。细菌用牛肉膏蛋白胨培养基，放线菌用高氏一号培养基。

1.2.6

菌种的复配试验。

1.2.6.1

复配菌株之间拮抗作用测试。将纤维素降解能力较强的6个菌株分别编号为F1、F2、F3、N1、N2、W1。在测定菌株F1对其他5个菌株是否具有拮抗作用时，将菌株F1点接到固体牛肉膏蛋白胨培养基中央，在30 ℃培养箱中静置培养24 h后，分别用猴头瓶均匀喷洒其他5个菌株在牛肉膏蛋白胨培养基表面，然后于30 ℃微生物培养箱静置培养24 h，观察是否有拮抗圈，并且测量其大小。以此类推，分别测定菌株F2、F3、N1、N2、W1对其他菌株是否具有拮抗作用。

1.2.6.2

复配菌株耐烟碱能力测试。将没有拮抗作用2个菌株的种子液等量加入配置好的烟碱浓度为0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的培养基中，30 ℃、170 r/min振荡培养24 h后，用分光光度计，以波长600 nm测量吸光度，测定无拮抗作用的复配菌株对烟碱的耐性浓度。

2 结果与分析

2.1 纤维素降解菌的分离、筛选和鉴定

2.1.1

纤维素降解菌的分离、筛选。以纤维素为唯一碳氮源，经过初筛和纯化，从发酵后的废弃烟沫中得到3株菌株F1、F2和F3;从牛粪肥料中得到2株菌株N1和N2;从味精下脚料中得到1株菌株W1，共6个纯的细菌菌株，确定为试验菌株。表1为筛选菌株的培养特性。菌株的菌落形态见图1。

表1 菌株的培养特征

2.1.2

菌种鉴定。由表2可知，菌株F1为

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtillis），菌株F3为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），菌株N1为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），菌株W1同样为

解淀粉芽孢杆菌（Bacillis amyloliquefaciens）。菌株F2和N2的2种鉴定方法的结果不同。这是由于2种鉴定方法的原理不同，用16S rDNA和特征性C源测序各有优缺点[14]。经过中国微生物研究所鉴定，菌株F2为枯草芽孢杆菌，菌株N2为母牛分枝杆菌（Mycobacterium vaccae）。

2.2 菌株生长曲线

以菌株液体培养的时间为横坐标，以各时间点所测得菌液的平均OD600值为纵坐标，绘制出各菌株的生长曲线。所有筛选到的菌种在适宜的条件下培养经历了延迟期、对数期、稳定期、衰亡期4个阶段。从图2可以

图1 菌株的菌落形态

表2 菌株的16S rDNA 和Biolog 鉴定结果

看出，0～4 h为F1和F3的延迟期，0～2 h为F2、N1、N2、W1的延迟期，菌种适应新的环境，繁殖的速度很慢;5～28 h为F1和F3的对数生长期，3～24 h为F2的对数生长期，3～10 h为N1的对数生长期，3～14 h为N2的对数生长期，3～22 h为W1的对数生长期，此时营养物质很充分，细菌呈对数快速增长;对数生长期后为稳定期，由于培养基中的营养物质不断地被消耗掉，细菌新陈代谢产生的毒性物质的积累及pH下降等因素的影响，细菌繁殖的速度逐渐下降，而死亡的细菌数开始逐渐增加，增殖数与死亡数渐趋平衡，细菌总数处于稳定的状态;当营养物质逐渐减少，而毒性物质越来越多，细菌的繁殖速度逐渐减缓，死亡菌数明显增多，衰亡的速度超过繁殖的速度，细菌总数呈现下降趋势，进入衰亡期。

2.3 菌株纤维素分解能力

刚果红琼脂培养基是较好的分离筛选培养基。纤维素降解菌能够在红色平板上形成透明圈（图3），且透明圈/菌落直径比值大致反映其降解纤维素能力[15]。从表3可以看出，将菌株按降解纤维素能力强弱顺序排列为N1>F3>N2> F2>F1>W1。

2.4 菌株耐烟碱能力测试

从表4可以看出，在烟碱浓度为0.1%时，菌株F2的烟碱耐性在0.05水平显著高于其他5种菌株，耐性最高，菌株F3与N1的烟碱耐性无显著差异，菌株N2的烟碱耐性最低;在烟碱浓度为0.2%时，菌株F3的烟碱耐性最高，菌株F1的烟碱耐性最低;在烟碱浓度为0.3%时，菌株F3的烟碱耐性最高，菌株F2和N1的烟碱耐性无显著差异，菌株W1的烟碱耐性最低;在烟碱浓度为0.4%时，菌株N2的烟碱耐性最高，W1的烟碱耐性最低;在烟碱浓度为0.5%时，菌种F2的烟碱耐性最高，菌种F1和W1的烟碱耐性无显著性差异，为最低。由此可知，菌株F2、F3和N2的烟碱耐性较好。

2.5 菌种组配试验

2.5.1

菌株之间的拮抗分析。从表5可以看出，N1与N2、N1与F1、N1与F2之间没有拮抗作用，可以进行复配试验。

图2 菌株的生长曲线

图3 菌株F3降解纤维素透明圈

表3 菌株大小及透明圈

2.5.2

复配菌株的耐烟碱能力研究。从表6可以看出，将N1和N2进行复配后的烟碱耐性要在0.05水平显著高于N1和N2纯菌株的烟碱耐性。在烟碱浓度为0.5%时，N1+N2在0.05水平显著高于N1，是N1烟碱耐性的4.34倍，同時在0.05水平显著高于N2，为N2的8.67倍。

表4 菌株的烟碱耐性

注：同列不同小写字母表示差异在0.05水平显著。

表5 菌株间的拮抗作用

注：“-”表示菌株间无拮抗作用;“+”表示菌株间有拮抗作用。

从表7可以看出，只有在烟碱浓度为0.2%和0.4%时，菌株复配后N1+F2的烟碱耐性在0.05水平显著高于N1和F2纯菌株的烟碱耐性;在烟碱浓度为0.1%时，复配菌株N1+F2的烟碱耐性为最低，仅为F2的92.3%。

从表8可以看出，菌株N1和F1复配后的烟碱耐性在各烟碱浓度上均在0.05水平显著高于菌株N1和F1的烟碱耐性。

表6 复配菌株N1、N2与纯菌株耐烟碱能力比较

注：同列不同小写字母表示差异在0.05水平显著。

表7 复配菌株N1， F2与纯菌株耐烟碱能力比较

注：同列不同小写字母表示差异在0.05水平显著。

表8 复配菌株N1， F1与纯菌株耐烟碱能力比较

注：同列不同小写字母表示差异在0.05水平显著。

从表9可以看出，在3种复配组合中，N1和N2菌株的复配后耐烟碱的效果在各烟碱浓度上均在0.05水平显著高于N1+F2，在烟碱0.2%浓度上与N1+F1处理之间无差异，超过烟碱0.3%浓度后，N1+F2处理耐烟碱能力在0.05水平显著高于N1+F1，分别是其1.15倍（0.3%）、1.99倍（0.4%）和1.58倍（0.5%）。

表9 三种复配菌株耐烟碱能力比较

注：同列不同小写字母表示差异在0.05水平显著。

3 结论与讨论

腐熟的作物秸秆含有大量有机质和烟草生长发育所必须的多种营养元素，可以增加土壤中腐殖质含量，改善土壤理化性质，增强地力，涵养水分，对促进烟株健壮生长、提高烟叶产质量都有积极作用[16]。近年来，对于作物秸秆降解菌的研究越来越受到关注[17]，但由于烟秆和烟叶具有烟碱的特殊性，烟沫废弃物的纤维降解菌不但具有较好的降解纤维素的能力，而且需要对烟碱有一定的耐性。该研究从废弃烟丝、腐熟牛粪、油枯有机肥、味精下脚料中分离并筛选出Bacillus subtillis，Bacillus amyloliquefaciens，Mycobacterium vaccae等6株对纤维素具有降解能力且不同程度耐盐碱的细菌。综合6株细菌分解烟沫纤维素能力和耐烟碱能力，最终确定适宜的烟沫废弃物堆置发酵腐熟菌种。然而，由于单一菌种的功能性有限，采用复配菌种更能达到预期效果[18]。Lwin等[19]分别用离体和活体2种方法验证了混合光合细菌对茄科劳尔氏菌的拮抗作用，发现这些有效的混合微生物不但可以通过增加植物光合和固氮作用提高作物产量，而且可以防控土传病害，加快降解土壤中的木质素。该试验综合菌株的各项综合能力，最终确定彼此

无拮抗作用的N1与N2复配构建烟沫专用腐熟菌种。该研究结果对解决当前有效利用烤烟废弃秸秆、烟叶及肥力转化有一定的实际意义。

竹江良等[11]研究认为，在烟草废弃物高温堆肥过程中，在添加合适猪粪比例的基础上加入外源微生物菌剂（NNY、FB），有利于堆体迅速进入高温分解阶段，延长高温分解持续时间，缩短发酵堆肥时间，显著增加腐熟后堆肥产品的总孔隙度和持水孔隙度，提高堆肥产品品质。吉增福等[20]对秸秆的营养转化做了详尽的研究，发现纤维分解菌用于对玉米秸秆的营养转化，能使营养水平低的秸秆的营养成分得到明显改善。其中，粗蛋白由5.22%提高到24.62%，粗脂肪由0.67%提高到12.52%，成为可替代15%～20%的混合日粮用于猪的饲料。在发酵过程中，一方面烟沫废弃物为菌种提供生存和繁育的营养，另一方面菌种加速物料中各种物质的分解与转化，使废弃物尽快“变废为宝”。

该试验筛选出的菌株N1和N2的纤维素降解能力较强，但其耐盐碱能力相比F3和F2较弱。这可能是由于菌株F2、F3从发酵烟丝中筛选出来的，其生存过程中已经适应较高浓度烟碱的环境，因此具有较强的耐盐碱。应用微生物处理烤烟废弃物作为一种安全、无污染环保形式，可以缩短烤烟废弃物的发酵时间，减少废弃物中有害成分（包括烟碱、蛋白质、果胶以及烟草特有的亚硝胺（TSNA）等）。将经过微生物处理的烤烟废弃物置于土壤中，有利于土壤结构的改良和养分的补充。随着生物技术的不断发展，微生物将具有更大的应用潜力。如何更加有效利用筛选出的6种菌株，并将其实际应用到田间有待进一步研究。

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