白桦悬浮细胞蛋白质组学分析体系的构建

郭磊 詹亚光 范桂枝

摘要 [目的]建立一套适合白桦悬浮细胞蛋白质组学分析的双向电泳体系。[方法]以白桦悬浮细胞为研究对象，采用改进的三氯乙酸（TCA）-丙酮沉淀法提取悬浮细胞蛋白，使用17 cm、pH 4.0～7.0的IPG胶条，9.0 μg/μl的上样量进行双向电泳。[结果]可得到蛋白质点数目多、分辨率高和重复性好的双向电泳图谱。PDQuest软件分析考马斯亮蓝染色后的凝胶，共得到约1 000个蛋白点。从这些蛋白点中随机选取3个蛋白点经基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 （MALDI-TOF MS） 分析后，搜索NCBInr 数据库对蛋白进行鉴定。结果显示，这3个蛋白分别为S-腺苷甲硫氨酸合成酶、transposase for IS1330和PadR家族转录调控蛋白。[结论] 为利用蛋白组学分析诱导子提高次生代谢物的积累机制奠定基础。

关键词 白桦;蛋白组学;悬浮细胞

中图分类号 S188;Q943 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）33-11638-03

Establishment of Proteomic Analysis of Suspension Cells in Betula platyphylla Suk.

GUO Lei， ZHAN Ya-guang， FAN Gui-zhi*

（College of Life Science， Northeast Forestry University， Harbin ，Heilongjiang 150040）

Abstract [Objective] To establish a two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis （2-D PAGE） system for suspension cell proteomic analysis of Betula platyphylla.[Method]the improved acetic acid （TCA） -acetone precipitation method was applied for suspension cell protein isolation and purification， and the key technologies of electrophoresis including the sample loading quantity and types of IPG strip were optimized. [Reault]The results indicated that the reproducible 2-D gel with more spots and high resolution electrophoresis diagram could be obtained by using the improved TCA-acetone precipitation method， with 9.0 μg/μl of loading protein sample on 17 cm IPG strip with pH 4-7. About 1 000 protein spots were obtained by PDQuest software analysis. 3 randomly selected protein spots were used to identify by matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry （MALDI TOF MS）. The identified 3 proteins were S-S-adenosylmethionine synthetase， transposase for IS1330 and transcriptional regulatory proteins of PadR family， respectively. [Conclusion] The study laid the foundation for using proteomics analysis inducer to improve secondary metabolites accumulation mechanism.

Key words Betula platyphylla Suk.; Proteomics; Suspension cell

基金項目 东北林业大学本科生创新项目“桑黄发酵产物中甾醇类物质的质量控制技术（20140225107）。

作者简介 郭磊（1993- ），男，山西常治人，本科生，专业：生物技术。*通讯作者，副教授，博士，从事生物工程研究。

收稿日期 2014-10-20

近年来研究表明，白桦（Betula platyphylla Suk.）三萜具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降脂、利胆和保肝等作用，特别是白桦酯醇、白桦酯酸等三萜物质作为天然药物在抗肿瘤和抗HIV等活性上显示出与以往药物不同的作用机制，靶向作用性更强，几乎无不良反应等特点[1-3]。因此，白桦三萜作为药物化学中的先导化合物而逐步受到研究者的注视。

前期研究表明，白桦酯醇和齐墩果酸等三萜物质可以在白桦愈伤组织和悬浮细胞中积累，但质量分数极低[4-5]。利用生物和非生物诱导子诱导白桦悬浮细胞，三萜含量明显提高，但目前诱导子提高次生代谢物积累的原因尚不明确。

新兴的学科蛋白组学为进一步揭示诱导子的作用机制提供了可能。蛋白质组学是从整体蛋白质水平上，在一个更加深入、更加贴近生命本质的层次上探讨和发现生命活动的规律和重要生理、病理现象的本质[6-8]。目前，植物蛋白质组学研究技术已日渐成熟，然而，利用蛋白组学在诱导子提高药用次生代谢物方面的研究报道却很少，若能利用蛋白组学分析诱导子诱导次生代谢物的积累，将有助于从整体和动态的蛋白质水平了解次生代谢物的诱导积累机制。因此，笔者建立白桦悬浮细胞的蛋白质分析体系，以期为利用蛋白组学分析诱导子提高次生代谢物的积累机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

白桦愈伤组织来自于白桦组培苗的茎段，筛选生长快、分散性好的白桦愈伤组织，将其继代若干次后转到液体培养基中悬浮培养。通过不断选择获得分散性好的细胞悬浮物，经过6代以上的转接，建立稳定的悬浮细胞系。

培养条件：固体培养基为NT培养基+0.1 mg/L 6-BA+0.01 mg/L TDZ，蔗糖20 g/L，琼脂粉5.3 g/L，pH 5.6～5.8。液体培养成分同固体培养基，但不加琼脂粉。培养基均以121 ℃高压灭菌20 min，培养温度为25～27 ℃，光照强度为2 000 lx，光照16 h/d，湿度为40%～50%，摇床转速为120 r/min。

取培养9 d的白桦悬浮细胞，立即放于液氮中速冻，放于-80 ℃ 保存待用。

1.2 样品的制备

取部分样品液氮研磨，粉末加入PBS、1 mmol/L PMSF、0.01 g/ml DTT，4 ℃振荡30 min;14 000 r/min 4 ℃ 离心30 min;上清加5倍体积的TCA-丙酮溶液，-20 ℃过夜沉淀;14 000 r/min 4 ℃ 离心30 min，去上清;加90%丙酮，14 000 r/min 4 ℃ 离心30 min，去上清，重复1次，室温晾干沉淀;加适量裂解液回溶，bradford法测量浓度，-80 ℃ 保存。

1.3 双向凝胶电泳

第1向等电聚焦凝胶电泳（IEF）采用17 cm，pH 3～10 IPG胶条，水化液组成为8 mol/L尿素，2%（质量分数）CHAPS，40 mmol/L DTT，0.6% （体积分数）Ampholyte （pH 3～10），0.002% （质量分数）溴酚蓝。总上样体积为500～800 μl，蛋白上样量为8.8～9.4 μg/μl，水化和等电聚焦在20 ℃下进行。其程序为0～500 V，500 Vh;500 V，2 500 Vh;500～3 500 V，10 000 Vh;3 500 V，50 000 Vh;3 500～500V，8 000 Vh。等电聚焦后的IPG胶条在平衡缓冲液I（50 mmol/L Tris-HCl 6.8 ，6 mol/L尿素，30%甘油，2% SDS，2% DTT，0.02% 溴酚蓝）中平衡15 min，然后在平衡缓冲液II（50 mmol/L Tris-HCl 6.8 ，6 mol/L尿素，30%甘油，2% SDS，2.5%IAA，0.02% 溴酚蓝）中平衡5 min。将IPG胶条从样品水化盘中移出，放到已配好的SDS-PAGE凝胶上端，并将marker放到凝胶的一端，再用0.5%的琼脂糖将胶条和marker封严，切忌不能产生气泡。并将胶板固定于电泳槽内。在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，进行考马斯亮蓝染色。

1.4 图像采集与分析

凝胶用GS-800校准型光密度仪（Bio-rad）进行扫描采集，所获得的凝胶图像用PDQuest（Bio-Rad）软件进行初步分析。

1.5 蛋白点的选取、酶解及质谱鉴定

从考染凝胶上随机选取3个蛋白点并用枪头切下后，用胰蛋白酶（Trypsin）进行酶解，肽段经MALDI-TOF MS 分析后得到肽质量指纹图谱（PMF）数据，将这些数据递交至MASCOT（http：//www.matrjxscience.corn）搜索引擎中，蛋白鉴定所使用的数据库为NCBInr数据库，主要参数设置与Yuan等的方法相同。

2 结果与分析

2.1 样品制备

样品制备是2-DE 成功与否的一个关键因素。对于木本植物白桦而言，次生代谢物如酚类、多糖等对蛋白质的提取影响很大。在参照木本植物TCA-丙酮提取方法的基础上，主要对预处理时的低温和细胞破碎方法进行调节，发现将悬浮细胞、研杵、研钵在-70 ℃低温预冷8 h 以上，采用液氮加少许石英砂和PVP的方法，蛋白质的提取量由5.02 mg/ml上升到5.79 mg/ml，同时得到了高分辨率的图片（图1）。

2.2 IPG胶条pH范围的确定

为进一步了解白桦悬浮细胞蛋白在2-DE图谱上的分布， 在上样量均为9.4 μg/μl 蛋白提取液的基础上，使用2 种pH分别是4.0～7.0和3.0～10.0的17 cm 线性胶条，发现大部分蛋白点集中于pH 4.0～7.0，而在碱性端检测到的蛋白较少（图1A）。pH 4.0～7.0 的胶条提高了酸性蛋白在凝胶上的分辨率，蛋白点的分布较为均匀，且多数蛋白点呈圆形，边界清晰。而pH 3.0～10.0胶条走出的蛋白点由于过于拥挤而呈雨点状。因此，在17 cm胶条的情况下，分离白桦悬浮细胞蛋白质时应采用pH 4.0～7.0的胶条。

注：A. pH 4～7 ;B. pH 3～10。

图1 不同pH梯度IPG胶条对蛋白质2-DE图谱的影响

2.3 上样量的确定

采用pH 4.0～7.0 的IPG线性胶条，分析8.8、9.0和9.4 μg/μl的上样量对白桦悬浮细胞蛋白质双向电泳分辨率的影响。结果表明，当上样量为8.8 μg/μl 时，蛋白点虽然无拖尾现象，但点数明显偏少，约900个点（图2A）;上样量为9.0 μg/μl 时， 检测出的蛋白点数达到1 000多个，整个凝胶图上的多数蛋白点呈圆形，边界清晰，分布较均匀，一些低丰度蛋白清晰可见（图2B）。上样量为9.4 μg/μl 时，蛋白检出率与上样量为9.0 μg/μl時无明显差别， 但一些高丰度蛋白在电泳过程中明显影响其他蛋白质，分子量或等电点相近的蛋白点无法有效分开，部分蛋白点有较为明显的拖尾（图2C ）。因此，白桦悬浮细胞蛋白质双向电泳上样量为9.0 μg/μl 左右时，电泳图谱效果较好。

2.4 蛋白点的等电点（pI）和分子量分析

对2次重复中可重复的917个蛋白点进行pI值（每0.5个pI范围为1个区间）和分子量（每10 kD为1个区间）分布分析，发现917蛋白点pI值和分子量分布基本上呈正态分布趋势（图3）。其中，大部分蛋白点的都分布于pI 5.0～6.0和分子量20～70 kD。

2.5 蛋白点的质谱鉴定

从胶上随机选取3个蛋白点进行MALDI-TOF MS分析，蛋白鉴定结果见表1。在鉴定的3个蛋白点中，没有来源于白桦树种的蛋白点，这3个蛋白点分别来源于Medicago sativa（紫花苜蓿）、Pectobacterium carotovorum subsp.、Lactobacillus jensenii（乳酸菌）物种，编码S-adenosylmethionine synthase（S -腺苷甲硫氨酸合成酶）、transposase for IS1330、PadR family transcriptional regulator（PadR家族转录调控）蛋白。

注：A. 8.8 μg/μl;B. 9.0 μg/μl;C. 9.4 μg/μl。

图2 不同上样量下蛋白质2-DE 图谱

图3 蛋白点的等电点（pI）和分子量（MV）分布

表1 蛋白点的鉴定

3 结论与讨论

在蛋白组学研究中，高质量的2-DE图谱是蛋白质进行质谱分析的前提，为此在利用蛋白组学分析某一生物的生理功能时，需要建立该生物的蛋白组学分析体系。样品制备是双向电泳实验中最基础也是最关键的环节之一[9-10]。因白桦悬浮细胞中脂类、多糖等生物大分子以及盐类小分子相对较少，且白桦细胞中蛋白的提取过程中没有用到盐溶液，因此白桦悬浮细胞样品制备方法较固定，即参照木本植物TCA-丙酮提取法。利用该方法提取的蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，蛋白点呈圆形， 分离均匀，几乎无横条纹和拖尾现象，重复性高， 说明此方法适用于白桦悬浮细胞蛋白的提取。而且，在采用传统TCA-丙酮提取法的基础上，发现将悬浮细胞、研杵、研钵在-70 ℃低温预冷8 h 以上，蛋白质的提取量由5.02 mg/ml上升到5.79 mg/ml。

蛋白质组是细胞内或组织中所有蛋白质总和，其中蛋白质数量巨大，蛋白质等电点也不同。为了最大限度地捕获蛋白质信息量，首先用pH范围较宽的IPG胶条（pH 3～10） 等电聚焦，然后根据双向电泳图谱上蛋白质点主要分布区域，选择pH范围相对较窄的IPG胶条，以增加相应区域蛋白点分辨率[11]。该试验结果显示，白桦悬浮细胞中的蛋白质大多在pH4～7的区域内，与pH 3～10 的IPG 胶条双向电泳结果相比，蛋白质点分离效果好、数量较多。该类胶条能充分反映蛋白质组信息，为后续研究的深入开展创造条件。

另外，蛋白质上样量是影响2-DE图谱清晰度及蛋白质点多少的因素之一。上样量过低，不利于检测低丰度蛋白质，但上样量过高又会导致蛋白质斑点过大，特别对于高丰度蛋白，严重影响其蛋白质组分的分离[12-13]。该试验结果显示，白桦悬浮细胞蛋白质双向电泳上样量为9.0 μg/μl 左右时，电泳图谱效果较好。

该研究初步构建了白桦悬浮细胞的蛋白组学分析体系，确定了白桦悬浮细胞的蛋白质提取方法为TCA-丙酮提取法，并确定了IPG 胶条pH为4.0～7.0，最佳上样量为9.0 μg/μl，并对分离出的3个蛋白点进行质谱分析，初步明确了被鉴定蛋白点的种类。该研究将为建立白桦的蛋白质组数据库及确定各蛋白质的作用模式、功能机理、调节机制及蛋白质之间的相互作用，对于研究白桦的生长发育机理、环境胁迫、遗传育种等具有重要的理论意义和实用价值。

参考文献

[1]MALGORZATA K，JAN Z，CEZARY P，et al.The formation of sugar chains in triterpenoid saponins and glycoalkaloids[J].Phytochem Reviews，2005，4：237-257.

[2] ALAKURTTI S，TARU M K，SALME K，et al.Pharmacological properties of the ubiquitous natural product betulin european[J].J Pharmaceutical Sci，2006，29：1-13.

[3] 李春雪，黄雅婷，范桂枝，等.不同白桦家系茎皮和枝皮中三萜含量的变异分析[J].经济林研究，2013，31（1）：44-47.

[4] 王博，范桂枝，詹亚光，等.不同碳源对白桦愈伤组织生长和三萜积累的影响[J].植物生理学通讯，2008，44（1）：97-99.

[5] 尹静，詹亚光，李新宇，等.不同树龄白桦的不同器官及其组培苗诱导的愈伤组织中白桦酯醇和齐墩果酸的分布和含量变化[J].植物生理学通讯，2009，45（6）：610-614.

[6] CASTIELLI O，CERDA B D，NAVARRO J A，et al.Proteomic analyses of the response of cyanobacteria to different stress conditions[J].FEBS Lett，2009，583：1753-1758.

[7] LEE K，BAE D W，KIM S H，et al.Comparative proteomic analysis of the short-term responses of rice roots and leaves to cadmium[J].J Plant Physiol，2010，167：161-168.

[8] ZHANG H X，LIAN C L，SHEN Z G.Proteomic identification of small，copper-responsive proteins in germinating embryos of Oryza sativa[J].Ann Bot，2009，103（6）：923-930.

[9] 胡敏，徐凌飞，张军科，等.梨叶片总蛋白提取及双向电泳体系的建立[J].西北农林科技大学学报：自然科学版，2012，40（1）：197-203.

[10] 徐超，吴小芹，林司曦，等.马尾松根部蛋白双向电泳分离体系的构建[J].南京林业大学学报：自然科学版，2011，35（1）：15-18.

[11] 孙杰，康俊梅，熊军波，等.野牛草种子蛋白质双向电泳体系的优化[J].中国草地学报，2010，32（4）：75-79.

[12] 李翠云，姜彥成，乔桂荣，等.海滨木槿叶片蛋白质双向电泳体系的建立[J].西南林业大学学报，2012，32（4）：30-35.

[13] 庄维兵，高志红，章镇，等.果梅花芽蛋白质双向电泳优化体系的建立[J].南京农业大学学报，2011，34（6）：47-52.