块茎与块根多酚氧化酶部分性质的比较

2014-10-21雷晗枭陈国伟李晓辉夏珊珊吴美仙

安徽农业科学 2014年33期

雷晗枭陈国伟李晓辉夏珊珊吴美仙

摘要 [目的]为高职学生实验《多酚氧化酶的制备和性质研究》筛选合适的实验材料。[方法]选取马铃薯和紫薯比较研究块茎与块根中多酚氧化酶（PPO）的活性、最适底物、最适温度等特性。[结果]两者PPO最适底物均为邻苯二酚;马铃薯PPO的最适反应温度为35 ℃，紫薯PPO的最适反应温度为10 ℃。[结论]经综合比较，该实验以马铃薯作为实验材料更为合适。

关键词马铃薯;紫薯;多酚氧化酶;活性

中图分类号 S532 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）33-11617-02

Comparision of Some Natures of Polyphenol Oxidase in Stem Tuber and Root Tuber

LEI Han-xiao， CHEN Guo-wei， LI Xiao-hui， WU Mei-Xian* et al

（Xiaoshan College of Science and Technology， Zhejiang Ocean University， Hangzhou， Zhejiang 311215）

Abstract [Objective]The objective of this study was to choose ideal experiment material for the students experiments-The Making and Natures Study of Polyphenol Oxidase（PPO） in higher vocational education. [Method]The potato and purple potato were selected to study some natures of PPO， including its activity， optimum substrate and optimum reaction temperature. [Result] Both of their optimum substrates were Catechol. The optimum reaction temperature of potato was 35 ℃，while that of purple potato was 10 ℃. [Conclusion]After comprehensive comparison， potato was more ideal as experiment material than purple potato in this experiment.

Key words Potato; Purple potato; Polyphenol oxidase （PPO）; Activity

基金项目 2013年度浙江海洋学院大学生科技创新项目（自然科学类）（浙海院团〔2013〕38号）; 浙江省教育厅科研项目（Y201225035）。

作者简介雷晗枭（1992- ），女，浙江临安人，本科生，专业：生物技术及应用。*通讯作者，高级讲师，硕士，从事生物化学的教学和研究工作。

收稿日期 2014-10-16

在高职生物化学《多酚氧化酶的制备和性质研究》实验过程中，笔者发现实验结果与教材中的理论结果不一致。经查阅相关文献，发现该实验设计可能有所欠缺。马铃薯的最适温度为5 ℃[1] 。在底物专一性这一实验过程中，并没有控制在最适pH和温度下完成。所以，可能正是这一原因导致实验结果与理论结果出现差异。此外，还发现不同蔬菜、水果的多酚氧化酶最适pH和温度不同，最适底物也有所差异[2-8]。为此，笔者将温度和pH调至最适后，选用价廉易得的马铃薯、紫薯作为试验品来验证、完善该实验。该实验结果可为学生实验材料的选择提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料供试材料为马铃薯、紫薯。

1.2 方法

1.2.1 马铃薯和紫薯PPO反应特性研究。

1.2.1.1 马铃薯和紫薯PPO粗酶液的提取。

参考李敏等[1]方法，并且改进。取一马铃薯，洗去上面的泥土，削皮后切成小块。称200 g小块马铃薯，立即加入磷酸盐缓冲液（pH 5.5），放入组织捣碎机中研磨2 min。把匀浆物料通过几层纱布过滤。将滤液于4 ℃、4 000 r/min下离心25 min，上清液即为酶提取液。将酶提取液置于4 ℃冰箱冷藏，待用时取出。

参考李新华等[9]方法，并且改进。随机称取50.0 g紫薯样品，迅速切成小块于组织捣碎匀浆机中，加入200 ml预冷的4 ℃磷酸鹽缓冲液（pH 6.0），匀浆40 s后过滤，将滤液在4 ℃、8 000 r/min冷冻离心15 min，上清液即为粗酶液。

1.2.1.2 马铃薯和紫薯PPO最大吸收波长的确定。

分别取2 ml马铃薯和紫薯PPO粗酶液于试管中，置沸水浴（80 ℃以上）加热1 min，使酶失活，反应产物在波长240～400 nm 范围内进行扫描。

1.2.1.3 马铃薯和紫薯PPO酶促反应最佳反应时间的确定。

分别取2 ml马铃薯和紫薯PPO粗酶液于一试管中，置沸水浴（80 ℃以上）加热1 min使酶失活。取出，待试管冷却后，在各试管中加4 ml蒸馏水。每隔5 min，检测马铃薯PPO在波长350 nm处、紫薯PPO在波长330 nm处的吸光度变化，确定其酶促反应的最适反应时间。

1.2.1.4 马铃薯和紫薯PPO最适底物的确定。

取马铃薯PPO粗酶液各2.0 ml于3支试管中，分别加入4.0 ml 0.2 mol/L的邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚，于10 ℃温度条件下保温反应10 min，测定其酶活力，吸光度最高的即为其最适底物。

取紫薯PPO粗酶液各2.0 ml于3支试管中，分别加入4.0 ml 0.2 mol/L的邻苯二酚、间苯二酚、对苯二酚，于35 ℃温度条件下保温反应10 min，测定其酶活力，吸光度最高的即为其最适底物。

1.2.1.5 马铃薯和紫薯PPO最适温度的确定。

分别取马铃薯和紫薯粗酶液各2.0 ml于4支试管中，再加入4.0 ml 0.2 mol/L的邻苯二酚底物，分别于10、20、30、40 ℃温度条件下保温反应10 min，测定其酶活力，吸光度最高时的温度即为其最适反应温度。

1.2.2 统计分析。

每次测定的试验数据用Microsoft Excel 2003软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 马铃薯和紫薯PPO最大吸收波长的确定

由图1可知，在320～350 nm范围内，随着波长的增加，马铃薯吸光度逐渐增大;在350～400 nm范围内，随着波长的增加，吸光度逐渐减小，马铃薯的最大吸收波长为350 nm。在240～330 nm范围内，随着波长的增加，紫薯吸光度略为增大;在330～400 nm范围内，随着波长的增加，吸光度逐渐减小，紫薯的最大吸收波长为330 nm。

图1 马铃薯和紫薯PPO最大吸收波长的比较

2.2 马铃薯和紫薯中PPO酶促反应进程及最佳反应时间的比较

由图2可知，马铃薯PPO酶促反应速率在10 min内，随着时间的推进反应加快，10 min时反应趋于稳定，之后反应变慢;紫薯PPO酶促反应速率的变化规律与马铃薯的一致。所以，试验方案设计中涉及的反应时间均为10 min。

图2 马铃薯和紫薯PPO酶促反应进程及最佳反应时间的比较

2.3 马铃薯和紫薯PPO最适底物的确定

由图3可知，马铃薯的最适底物为邻苯二酚，其次是对苯二酚。由图4可知，紫薯的最适底物为邻苯二酚，其次是对苯二酚。

图3 马铃薯PPO最适底物

图4 紫薯PPO最适底物

2.4 马铃薯和紫薯PPO最适反应温度的比较由图5可知，随着温度的提高，马铃薯PPO活性增加，15 ℃时出现一小波峰;以后随着温度的升高，PPO活性迅速下降;当温度升至35 ℃时，出现最高波峰，此时的PPO活性最大。随着温度

的提高，紫薯PPO活性增加，10 ℃时出现波峰，此时的PPO活性最大;以后随着温度的升高，PPO活性迅速下降;当温度升至40 ℃时，又出现小波峰。小波峰的存在可能预示着存在同工酶[1]。因此，马铃薯、紫薯PPO的最适温度分别是35、10 ℃。

图5 马铃薯和紫薯PPO最适反应温度

3 结论