乌司他丁减轻重症中暑大鼠肺的炎症和氧化损伤

陈怿 童华生 张兴钦 江东新 苏磊

DOI：10.3760/cma.j.issn.1671-0282.2014.08.009

基金项目：国家自然科学基金（81101406， 81071529）

作者单位：523900 广东省东莞，东莞市太平人民醫院 暨南大学附属东莞医院（陈怿、江东新）； 广州军区广州总医院重症医学科 解放军热区损伤与组织修复重点实验室（童华生、张兴钦、苏磊）

通信作者：苏磊，Email：slei_icu@163.com

【摘要】目的 观察乌司他丁对重症中暑大鼠肺损伤的作用。

访法 48只大鼠随机（随机数字法）分为空白组（HS）、低剂量乌司他丁组（LUTI）、高剂量乌司他丁组（HUTI）和对照组（Sham）4组，每组12只。通过人工气候舱制备重症中暑大鼠模型，监测直肠温度（Tc）、监测心率（HR）和平均动脉压（MAP），记录Tc>42℃的时间和重症中暑发生时间，分别于热打击开始后0 min、20 min、40 min和60 min采动脉血检测血氧分压（PaO₂）和二氧化碳分压（PaCO₂），并于60 min留取支气管肺泡灌洗液（BALF）并用酶联免疫法检测其中的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）和白介素-6（IL-6）质量浓度，收集肺组织进行病理分析和诱导性氧化亚氮（iNOS）的Western blot检测。采用PASW Statistics 17.0统计软件行方差分析，生存分析使用Kaplan-Mier曲线和Log Rank检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

结果 LUTI和HUTI组相比HS组在Tc>42 ℃的时间（P=0.00）、重症中暑发生时间（P=0.00）和中位生存时间（P=0.00）均延长。热打击后60 min时HS组PaO₂较其他三组明显降低（P=0.00），而LUTI和HUTI组之间差异无统计学意义（P=0.91）。同时，HS组PaCO₂较其他三组明显升高（P=0.00），LUTI和HUTI组之间差异无统计学意义（P=0.79）。LUTI和HUTI组大鼠的BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6浓度较HS组低（P=0.00， P=0.00和P=0.00），而且HUTI组的炎症介质浓度也低于LUTI组（P=0.02， P=0.04和P=0.04）。病理结果显示LUTI和HUTI组大鼠肺损伤较HS组轻（P=0.00）。肺组织iNOS蛋白表达比较中，HS组较LUTI和HUTI组增加（P=0.00），而LUTI组表达量也高于HUTI组（P=0.03）。

结论 乌司他丁具有改善重症中暑大鼠呼吸衰竭和预后的效果，这种作用可能与减轻肺组织的炎症和氧化损伤有关。

【关键词】重症中暑；乌司他丁；肺损伤；动脉血气；支气管肺泡灌洗液；白介素；肿瘤坏死因子；诱导性一氧化氮酶

The study of Ulinastatin to reduce pulmonary inflammation and oxidative injury in rats with severe heatstroke Chen Yi，Tong Huasheng ，Zhang Xingqin， Jiang Dongxin， Su Lei. *Department of Critical Care Medicine ，Taiping Peoples Hospital of Dongguan/Dongguan Hospital Affiliated to Jinan University， Dongguan 523900， China

Corresponding author：Su Lei，Email：slei_icu@163.com

【Abstract】Objective Toinvestigate the effect of ulinastatin on acute lung injury in rats with severe heatstroke. MethodsFourty-eight rats were randomly（random number） assigned into control group（HS group， n=12）， low dose Ulinastatin group（LUTI group， n=12）， high dose Ulinastatin group（HUTI group， n=12） and non-thermal group（Sham group， n=12）. Rats were prepared with pre-warm chamber to initiate heatstroke. The change of rectum temperature （Tc）， heat-rate （HR） and mean arterial pressure （MAP） under heat-stress were recorded. The time-point of heatstroke onset and Tc >42 ℃ was observed. Arterial blood samples were draw at 0 min，20 min，40 min and 60 min for testing partial pressure of oxygen（PaO₂）and partial pressure of carbon dioxide（PaCO₂）. Bronchoalveolar lavage fluid（BALF） were collected at 60 min， and the concentrations of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-1β （IL-1β） and interleukin-6（IL-6） in BALF were measured with enzyme linked immunosorbent assay kit. Lung tissues were harvested for observing pathological change and measuring the expression of iNOS with Western blot test. Results Compared with HS group， the time-point of Tc>42℃（P=0.00），severe heat-stroke（P=0.00） and the median of survival time（P=0.00） in LUTI and HUTI groups were significantly increased. At 60min after heat-stress， the level of PaO₂in HS group was much lower than those in other groups（P=0.00）.But there were no differences between LUTI and HUTI groups（P=0.91）. The value of PaCO₂in HS group was much higher than those in other groups （P=0.00）. And the differences between LUTI and HUTI groups were no significant （P=0.79）. The concentrations of TNF-α， IL-1β and IL-6 in HS group was the highest in four groups （P=0.00， P=0.04 and P=0.04）， followed by LUTI， HUTI and Sham group. The concentrations of proinflammatory cytokine in LUTI were higher than those in HUTI group （P=0.02，P=0.00，P=0.00）.Compared with HS group， the pathological injuries were alleviated in LUTI and HUTI group（P=0.00）. The expression of iNOS in lung tissue of HS group was strengthened than LUTI and HUTI group（P=0.00），and there was a significant difference between LUTI and HUTI group（P=0.03）.Conclusion Ulinastatin improves respiratory dysfunction and the prognosis of severe heatstroke rats through reducing the inflammatory and oxidative injury in lung tissue.

【Key words】Severe heatstroke； Ulinastatin； Lung injury； Arterial blood gas； Bronchoalveolar lavage fluid； Interleukin； Tumor necrosis factor； Inducible nitric oxide synthase

由于重癥中暑有热损伤、全身炎症反应（SIRS）和凝血功能异常等多个病理损伤机制的参与，常常迅速地发展成多脏器功能异常（MODS）^[1-2]。组织与脏器损伤是重症中暑常见的临床表现，横纹肌溶解、循环衰竭、肝肾功能异常、脑水肿和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）等均可在病程中出现。有接近75%的重症中暑患者可进展成MODS，其中呼吸系统是最常见的打击器官之一^[2]，但目前肺损伤的机制仍未十分明确，且缺乏确切有效的特异性治疗方法。乌司他丁具有稳定溶酶体膜、抑制溶酶体酶的释放、清除自由基和抑制炎症因子释放等作用。乌司他丁联合其他药物的治疗在脓毒症的动物和临床研究中证实具有良好的脏器保护作用^[3-5]。由于其具有良好的效果，所以笔者推测乌司他丁对重症中暑大鼠肺组织也具有保护性作用，本研究拟观察乌司他丁的保护性作用并探讨其机制。

1材料与方法

1.1实验动物

由于雌激素对中暑发生及脏器损伤的影响^[6]，故选用SPF级健康成年雄性Wsitar大鼠48只（220～260 g），实验流程经伦理委员会审核通过。

1.2试剂与仪器

注射用乌司他丁由广东天普生化医药股份有限公司提供。血气分析仪（GEM3000，IL公司，美国）。多通道生理记录仪（Drager公司，德国）。离心机（AllegraTM 6，BECKMAN公司，美国）。显微镜（BX51T， OLYMPUS公司，日本）。ELISA双抗夹心法试剂盒（SHINO-TEST公司，日本）。

1.3实验分组

48只雄性Wista大鼠随机（随机数字法）分配为空白组（HS），低剂量乌司他丁组（LUTI），高剂量乌司他丁组（HUTI）和对照组（Sham）共4组，每组各12只。每组各有6只用于观察生理指标变化、重症中暑的发生时间和生存时间，另外6只于热打击开始后60 min处死并留取标本。LUTI组和HUTI组分别造模前72 h连续尾静脉注射乌司他丁溶液，剂量分别为5000 U/（100 g ·12 h）和10 000 U/（100 g ·12 h）。HS组和Sham组造模前72 h连续尾静脉注射生理盐水0.5 mL/（100 g ·12 h）。Sham组接受动脉置管但不进行热打击，6只在室温下观察100 min，另外6只在实验开始后60 min处死取材。

1.4重症中暑模型制备

所有实验动物验前6 h禁食2 h 禁水，予1%戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉后，右侧股动脉穿刺置入静脉留置套管针，多通道生理监护仪监测Tc、HR和MAP。将Sham组动物置于25 ℃室温下观察， HS、LUTI组和HUTI组置于人工气候舱内[温度（40±2）℃和湿度（65±5）%]，当大鼠Tc>42℃且MAP较峰值下降超过25 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）时定义为重症中暑^[7]，继续于气候舱内观察至死亡，记录热打击下3组大鼠Tc>42 ℃的时间、重症中暑发生时间和生存时间。

1.5动脉血气分析

根据本团队之前的实验结果^[8]，分别于实验开始前（0 min），热打击后20 min、40 min和60 min于股动脉置管处抽取动脉血（0.5 mL）进行动脉血气分析，记录血氧分压（PaO₂）和二氧化碳分压（PaCO₂）。

1.6 BALF收集及肺病理分析

热打击后60 min大鼠注射大剂量戊巴比妥钠处死，开胸气管插管灌洗留取BALF后进行离心（800 g，10 min），收集上清后冰冻于-80℃保存。完整取下大鼠右肺，进行苏木精-伊红染色法制成病理玻片，将所有玻片随机编码后请病理医师在光学显微镜下进行盲法病理损伤计分，病理损伤计分参照Hong等^[9]学者标准。

1.7BALF中炎症因子的测定

BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6浓度测定采用酶联免疫（ELISA）双抗夹心法试剂盒，根据说明书指示操作，用酶标仪在450 nm波长下测定样本光密度（OD值），计算样品浓度。

1.8肺组织诱导性氧化亚氮酶（iNOS）的表达

留取左肺组织，对iNOS的表达使用Western-blot法进行检测，用凝胶成像分析仪分析目标条带和内参条带的光密度值，以两者的比值（IDV）作为蛋白表达定量指标。

1.9 统计学方法

计量资料以均数±标准差（x±s）表示，血气指标整体效应4组间比较使用重复测量方差分析、某时间段组间或组内不同时间比较采用单因素方差分析，其余计量数据采用单因素方差分析，所有数据均使用PASW Statistics 17.0软件进行统计处理。各组生存分析使用Kaplan-Mier生存曲线和Log Rank检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1热打击下大鼠Tc>42 ℃的时间、重症中暑发生时间和生存时间

热打击下，HS组、LUTI组和HUTI组Tc均逐渐上升，与HS组相比较，LUTI和HUTI组大鼠Tc>42 ℃的时间都延长（P<0.01），但是两组间差异无统计学意义（P>0.05）。LUTI组和HUTI组的中暑发生时间较HS组明显延迟（P<0.01），而HUTI组也较LUTI组延迟（P<0.01），见表1。HS组大鼠中位生存时间为68 min（95%CI66.6～70.4），LUTI组中位生存时间为85min（95%CI83.3～86.6），HUTI组中位生存时间为91 min（95%CI88.6～93.4），各组生存时间比较差异具有统计学意义（P<0.01），见图1。

2.2 血气指标

热暴露后60 min时HS的 PaO₂较其他三组低（P<0.01），而LUTI和HUTI组之间差异无统计学意义（P>0.05）。热暴露后60 min时HS的 PaCO₂较其他三组明显升高（P<0.01），LUTI、HUTI组均较Sham组降低（P<0.01），LUTI和HUTI组之间差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.3 BALF炎症因子浓度

4组中BALF的TNF-α、IL-1β和IL-6浓度比较中，HS组明显高于其他3组（P<0.01），HUTI组较LUTI组降低（P<0.05）；见表3。

2.4 肺组织病理变化

病理观察发现HS组出现了大量肺泡塌陷，血管充血并周围间质增厚，肺泡和间质可见大量炎症细胞浸润。LUTI组和HUTI肺泡病变较HS组轻，局部仍可见肺泡结构，炎症及渗出也较HS组明显减轻，见图2。HS组、LUTI组、HUTI组和Sham组肺病理损伤计分分别为（12.7±1.4）、（10.1±0.9）、（6.1±0.7）和（0.5±0.5），组间比较，P=0.00，HS组与其他3组比较，均P=0.00，LUTI与HUTI组比较，P=0.00。

2.5 肺组织iNOS的表达

各组大鼠肺组织iNOS的表达通过Western-blot检测（图3），半定量分析结果显示HS组表达量最高为2.5±0.8，LUTI和HUTI组的表达次之，分别为0.8±0.3和0.4±0.2，Sham组最少，为0.1±0.1。各组间比较，P=0.00，HS组与其他三组比较，均P=0.00， LUTI与HUTI组比较，P=0.03。

3 讨论

明确重症中暑发生脏器功能损害的机制，早期进行预防、干预和支持，可有效地阻止重症中暑向MODS发展，从而降低病死率和改善预后，这是治疗策略中仅次于“快速降温”之后的“第二个关键点”^[10]。研究已经证实热打击下啮齿类动物肺组织可出现间质增厚、肺泡出血等一系列的病理改变^[11]，但目前对肺损伤的机制及救治仍缺乏研究和认识。

乌司他丁具有修复胃肠屏障、调控炎症介质、改善凝血、保护血管内皮等效果^[12]。在缺血-再灌注、烧伤和吸入性肺损伤的研究中发现乌司他丁不仅可以减轻肺的炎症损伤，还可以改善氧化应激，甚至还能抑制肺纤维化^[13-16]。乌司他丁还可通过调理免疫对内毒素介导肺损伤发挥保护作用^[17]。乌司他丁可减轻重症中暑患者血管内皮细胞的损伤^[18]，因此本实验拟通过观察中暑大鼠生理变化、中暑发生时间、血气参数、BALF中炎症因子浓度、肺病理和肺组织iNOS表达等指标，分析乌司他丁对重症中暑大鼠肺组织的保护作用及其机制。

乌司他丁的干预不仅有效地延迟热打击下大鼠体温的升高，还可以延长大鼠在热应激下的中暑发生时间和生存时间，提示乌司他丁可改善热应激下大鼠的预后。笔者同时发现LUTI组和HUTI组之间对延缓体温上升差异无统计学意义，但是在两组间中暑发生时间和生存时间的比较上，HUTI组却表现出剂量优势，推测这与乌司他丁对热应激下体温调节中枢功能并无直接影响，但可以通过减轻机体应激反应及SIRS延缓体温骤变，随着机体应激及SIRS加剧，其剂量效应的区别才逐渐显现，尤其是在体温超过42 ℃之后，最终表现为延长机体耐受性及存活时间。热暴露开始后的前40 min后，热打击下的3组大鼠与Sham组大鼠血气指标相比差异无统计学意义，是机体处于应激代偿的生理反应，这与其他学者中暑研究相似。在约60 min时，HS组大鼠出现呼吸功能衰竭失代偿，此刻HUTI组和LUTI组在乌司他丁的保护下呼吸系统未出现衰竭表现，但是此时这两组间血气指标无明显区别，推测与该检测时间点仍未能体现两组间差别有关。结合该实验中对血气指标变化的观察，推论乌司他丁对重症中暑大鼠的保护效应与有效延缓热应激下大鼠呼吸功能衰竭有关。

本实验进一步对这种保护性作用进行探讨。第一，在中暑大鼠BALF的炎症介质浓度检测中发现，乌司他丁可明显降低BALF中炎症因子水平，而且这种作用具有剂量依赖性，这与本团队之前临床研究结果相似。由于IL-1β和IL-6等炎症介质与中暑病情危重程度有密切相关性^[22]，因此乌司他丁减少炎症因子的释放是其改善中暑动物的预后的机制之一。第二，在肺的组织学及病理损伤计分的直观比较中，乌司他丁也显示出与剂量相关的保护作用。第三，在各组大鼠肺组织中iNOS表达的比较中，发现乌司他丁可以有效的减少热应激下肺组织中iNOS表达，由于iNOS是产生一氧化氮自由基的主要介质，直接反应机体的氧化应激状态，是造成肺急性氧化损伤的重要介质^[20-23]，所以iNOS的表达水平与肺的氧化损伤程度具有正相关性，其结果反映了乌司他丁可肺組织降低iNOS的表达从而缓解氧化应激损伤。综合以上三点，笔者推断乌司他丁的肺保护作用可能与抑制肺组织炎症细胞浸润、减少炎症因子释放和缓解氧化应激损伤有关，可能为临床救治重症中暑集束化治疗的重要部分。

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（收稿日期：2014-01-23）

（本文编辑：何小军）

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