一株高雄山虫草的分子鉴定

郝芳芳 王秀然 张天柱 刘思阳 王岩 卢天成

摘要 [目的] 利用生物信息学方法初步探讨虫草属日本拟青霉的分类地位。[方法] 提取日本拟青霉的基因组，并利用通用引物ITSL和ITS4采用PCR技术扩增rDNA18S28S ITS序列。采用Clustalx1.83和MEGA5软件构建系统发育树，生物信息学比较分析确定其分类地位。[结果]PCR扩增产物为603 bp。将日本拟青霉重新命名为雪花高雄山虫草（Cordyceps takaomontana strain JLsnow）。将虫草重新分类，并对该类群及其特征进行了描述。[结论] 从分子水平上说明日本拟青霉与其他虫草之间的差异，该研究为虫草属真菌的分类提供新思路。

关键词 冬虫夏草；ITS；进化树；日本拟青霉；雪花高雄山虫草

中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）31-10848-03

Molecular Characterization of a Cordyceps takaomontana Strain

HAO Fangfang1， WANG Xiuran1， ZHANG Tianzhu2， LU Tiancheng et al

（1. College of Life Sciences， Jilin Agricultural University， Changchun， Jilin 130118； 2 College of Pharmacy， Changchun University of Chinese Medicine， Changchun， Jilin 130117）

Abstract [Objective] The aim was to discuss classification position of Cordyceps takaomontana using bioinformatics methods .[Method]Genome of Paecilomyces japonica were extracted and rDNA18S28S ITS sequences by PCR using universal primers ITSL and ITS4 were amplified， followed by sequencing.[Result] The PCR amplified product was 603 bp .Comparative analysis of bioinformatics using Clustalx1.83 and MEGA5 software was clone to construct a phylogenetic tree， and the molecular taxonomic status was identified according to our newdivided taxon. Paecilomyces japonica should rename as Cordyceps takaomontana strain JLsnow. Species included in this taxon and their characteristics were described. [Conclusion] The difference between Japan Cordycepstakaomontana and Chinese cordyceps fungi was devealed，and the study provided new ideas for the classification of cordyceps fungi.

Key words Cordyceps； ITS； Phylogenetic tree； Peacilomyces japonica； Cordyceps takaomontana

冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis）是由子囊菌纲真菌寄生在蝙蝠蛾幼虫尸体的子座-幼虫复合体。冬虫夏草具有较高的滋补保健功效，是世界上最稀有、珍贵的药用真菌之一^[1]。冬虫夏草的自然资源十分稀少。日本拟青霉（Peacilomyces japonica）作为食用蘑菇在韩国被广泛应用，这可能是新的替代虫草的资源。然而其分类地位不明确^[2-5]。虫草属是一个多品种复杂的真菌群，在种属分类水平上关系复杂。目前学者经常使用电源系统研究虫草亚属或亚群的分类^[6]。然而，虫草是一个品种多样且形态复杂的物种。形态学描述没有统一的标准，因此形态的描述过于主观。另外，在多种因素的作用下有些菌株的形态和生理生化指标均不稳定。此外，形态学的最大缺点在于它不能应用于活菌。因此单独使用传统的分类方法可能不能解决这些问题^[7-8]。

分子生物學技术在真菌分类上介绍了更具体、准确而可靠的分子生物学技术的鉴定方法，如DNA碱基组成分析、限制性片段多态性（RFLP）、随机扩增多态性DNA（RAPD）、脉冲电场凝胶电泳（PFGE）和小亚基rDNA或rRNA测序^[9]。这些方法弥补了传统分类的不足，为真菌分类学的研究开辟了途径。真菌的核糖体DNA（rDNA）是指rRNA基因簇的重复单元，包括5.8S，18S和28S rRNA基因及其相邻的非转录间隔区（NTS）和非转录区（NTR），有些生物物种中还包括5S rRNA。rDNA基因序列在进化过程中保守强、拷贝数多，且包含可变区和高变区。因此，rDNA基因序列分析是真菌分类学家关注的焦点。对于大多数真核生物而言，rDNA包括非转录区（NTS）、18S rDNA的外部转录间隔区（ETS）、5.8S rDNA的内部转录间隔区1（ITS1）、28S rDNA的内部转录间隔区2（ITS2），总长度为7.7～24 kb^[10]。

18SrDNA 的序列信息还不足以对真菌种间进行精确鉴别，必须借助其他序列信息作补充，ITS序列信息起到了很好的作用。ITS1和ITS2是中度保守的区域，且种内保守性相对一致，但种间差异明显。这些特性使ITS适用于真菌物种的分子鉴定，以及属内物种间或种内差异明显的亲缘关系的分析。rDNA的 IGS区（NTS，ETS）速度进化最快，与ITS区域相比，IGS区域因为变异太高不适宜某些真菌的种间鉴别^[11]。总体而言，真菌rDNA的基因间隔区（NTS，ETS，ITS）为高度重复序列，且该序列的重复数在菌株之间的差异明显。采用适当的引物或探针利用PCR或Southern杂交显示菌株多态性可作为研究真菌类群属种水平的分类学指标。该rDNA编码的基因序列（5.8S，18S和28S rDNA序列）具有较强的保守性，所以最能反映真菌间的亲缘关系。

笔者扩增日本拟青霉的rDNA基因并分析了18S rDNA和ITS序列，利用生物信息学方法初步探讨虫草属日本拟青霉的分类地位，通过对日本拟青霉进行分子鉴定，从分子水平上说明日本拟青霉与其他虫草之间的差异，以期为虫草属真菌的分类提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料 由东北师范大学生命科学学院太龙杰教授提供日本拟青霉菌株并存储在实验室中。固体培养基：马铃薯提取物20 g，蔗糖2 g，瓊脂2 g，蒸馏水100 ml。液体培养基：马铃薯提取物20 g，蔗糖2 g，蒸馏水100 ml。市场上购买的桑蚕蛹。天恩泽基因组提取试剂盒用于基因组提取。

1.2 日本拟青霉的栽培 将该菌株切成块，分别接种于固体平板上27 ℃培养6 d。将活化好的菌种取1 cm2小块接种至含有100 ml液体培养基的三角瓶中，25 ℃、140 r/min培养48 h。对日本拟青霉进行固体培养：将10 ml培养液接种至含有100 g蚕蛹的无菌瓶中，27 ℃培养7 d，然后在20～25 ℃下培养，湿度90%，弱光培养25～30 d。子实体和基质形态记录：子实体的长度、直径、重量。

1.3 PCR扩增和测序 菌丝体离心后将沉淀转移至一个塑料研钵中，液氮研磨成粉末，然后转移到1.5 ml Eppendorf管中。使用天恩泽基因组提取试剂盒提取基因组DNA。通用引物如下：fwd_itsl：5′tcg taa caa ggt ttc cgt agg tg3′，rev_its4：5′tcc tcc gct tat tga tat gc3′。PCR条件：94 ℃ 5 min；94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃1 min，30个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行分离（电压120 V，时间15～20 min）。将该序列用Axigen 凝胶回收试剂盒（Axygen Co.，China）进行回收并送出测序（北京华大公司）。

1.4 系统进化树构建

在NCBI GenBank上提交该序列，编号为JQ009304.1。在NCBI上进行比对相似度最高的序列确定为分离真菌的分类地位。使用clustalx1.83软件进行序列比对，MEGA5用于构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 形态学分析 日本拟青霉菌株以蚕蛹作为培养基加湿培养30 d。日本拟青霉的外观形态见图1。子座湿度低，孢子化程度较低仅顶部有孢子覆盖，子实体平均株高4.4 cm，子实体平均湿重0.161 g/10根，平均干重0.049 g/10根，干

湿比0.305。相比之下，人工栽培蛹虫草子实体的平均株高

为2.0～6.3 cm；子实体的平均湿重最低0.002 g/10根，最高

2.3 系统进化树 分析了日本拟青霉菌株的5.8SrDNA和ITS序列，并结合NCBI GenBank中已有的日本拟青霉的5.8SrDNA和ITS序列，构建了虫草属的系统发育树，并确定了日本拟青霉菌株的分类地位。日本拟青霉的5.8SrDNA和ITS序列与其他虫草菌株比对结果（图4）显示，日本拟青霉与高雄山虫草聚类成一支，相似度为99.4%，bootstrap可信度分析达45%。这个虫草菌株与虫草属的其他3个品种即双缩孢虫草

（Cordyceps bifusispora）、高雄山虫草（塔萨虫草）（Cordyceps cf.takaomontana）和珊瑚虫草（Cordyceps martialis）先后聚类。其中日本拟青霉与高雄山虫草（塔萨虫草）bootstrap可信度分析达45%，相似度为99.9%；日本拟青霉的ITS序列与高雄山虫草

（Cordyceps takaomontana（AB189443））的相关序列亲缘关系非常接近，其序列之间的相似度达100.0%。而日本拟青霉、高雄山虫草和珊瑚虫草聚类成一支，bootstrap可信度分析达61%，相似度为89.9%。日本拟青霉的ITS序列与珊瑚虫草的相关序列的相似度高达95.8%。与双缩孢虫草和珊瑚虫草相比，日本拟青霉与高雄山虫草的相似性最高，这显示日本拟青霉和高雄山虫草为虫草属中同一物种。因此，将日本拟青霉重新命名为雪花高雄山虫草（Cordyceps takaomontana strain JLsnow）。

3 讨论

NJ树通过邻接法（NJ）利用试验序列和Genbank 序列所构建的系统聚类树可以看出，同属聚类在一起，且各物种又形成相对独立的枝，其支持率基本上可信。基于COI序列的NJ树能够明显地看出虫草不同的种属能够很好地区分开。日本拟青霉所在群包括16个种，分别是Cordyceps ninchukispora strain，Cordyceps militaris^[13]，Cordyceps roseostromata strain ARS，Cordyceps kyushuensis voucher Y.L.Guo HMAS 78115^[14]，Cordyceps confragosa，Cordyceps scarabaeicola^[15]，Cordyceps scarabaeucika，Cordyceps cf.militaris，Cordyceps bassiana^[16]，Cordyceps brongniartii^[17]，Cordyceps tuberculata strain BCC16819^[18]，Cordyceps spegazzinii^[19]，Cordyceps bifusispora^[20]，Cordyceps cf.takaomontana BCC28612，Cordyceps martialis^[21]，雪花高雄山虫草（Cordyceps takaomontana strain Jlsnow）^[22]，高雄山虫草（塔萨虫草）（Cordyceps takaomontana）^[22]。这16个种聚类成大小不等的2支，较小的1支包含4个种类，bootstrap可信度分析最低为46%，最高可达95%，相似度大于78.6%。较大的一支包含12个种类，bootstrap可信度分析最低为32%，最高可达83%，相似度大于85.6%。雪花高雄山虫草与高雄山虫草（塔萨虫草）被归为同一个物种。

該群的特征包括：①寄主是鳞翅目昆虫蛹、鳞翅目幼虫，雪花冬虫夏草的寄主为鳞翅目蛹。②基质单生或群生，橙黄色或红色的 根状菌索固着在寄主上，由寄主的头部和其他部分出芽，为圆柱状或棒状，通常有一个尖端，高1～9 cm，头部和柄可分枝，橙红色，柄多弯曲；头部棒状，孢子线性有许多隔膜。雪花高雄山虫草的形态学特征为基质群生，子实体为淡黄色固着于寄主上，呈圆柱状，具有尖锐的顶端，高4～5 cm；头部呈棒状，有分枝。两者的形态特征非常相似。③寄主蛹大多布满白色菌丝。雪花高雄山虫草寄主蛹外也布满雪白色的菌丝（因此而得名）。④它们分布在潮湿的地区，如中国浙江、安徽、河南、福建、广东、台湾以及日本。雪花高雄山虫草分布在中国台湾和日本等气候潮湿的地区。分布情况也表明该研究的雪花高雄山虫草与所在虫草属群具有很高的亲缘性。

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