小麦幼胚愈伤组织的诱导

李洁等

摘要：为建立小麦（Triticum aestivum Linn.）幼胚的转化体系，获得转基因的小麦再生植株，对小麦幼胚进行愈伤组织诱导。以新春6号和新春9号小麦幼胚为试验材料，选择不同诱导培养基对幼胚进行愈伤组织诱导。结果表明，4种培养基诱导的愈伤组织质量和诱导率有明显的差异，其中MCIMA+KT高于其他3种培养基，新春6号和新春9号诱导率分别为53.80%和52.25%，愈伤组织的质量级别为A级，属于极适宜进行遗传转化状态。SD2培养基上诱导出的2个小麦品种愈伤组织分别为0.002%和0.59%，是不适宜进行遗传转化的培养基。新春6号和新春9号2个基因型诱导的愈伤组织数量和质量之间没有明显差异，适于进行遗传转化。

关键词：小麦（Triticum aestivum Linn.）；幼胚；愈伤组织；诱导

中图分类号：S512.1；Q943.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）16-3930-03

Abstract： To establish the transformation system of wheat immature embryos， and regenerate transgenic wheat plants， Xinchun 6 and Xinchun 9 immature embryos of wheat were used to screen medium for callus induction of immature embryos with different induction. The results showed that 4 kinds of culture media had significant differences between quality and induction rate of the callus induced. MCIMA + KT was significantly higher than other three with induction rate of 53.80% and 52.25% and the A level of callus. It was suitable for genetic transformation. The induction rate of the SD2 callus was 0.002%and 0.59% and was not appropriate for genetic transformation of the culture medium. XinChun 6 and XinChun 9 wheat had no obvious difference between quantity and quality on two genotypes of callus induced， both were suitable for genetic transformation. The best suitable time for immature embryos culture of spring wheat Xinchun 6 and XinChun 9 were 3～4 d after flowering.

Key words： Triticum aestivum Linn.； immature embryo； callus； induction

小麦（Triticum aestivum Linn.）是世界上分布最广的粮食作物。传统育种技术存在育种周期长、增产潜力有限等局限性，造成了培育新品种的障碍。目前，对玉米（Zea mays）、大豆（Glycine max）、棉花（Gossypium spp.）在转基因方面研究较为成熟，而小麦仍处于转化体系的建立和完善阶段[1]。自1992年Vasil首次获得抗除草剂的转基因小麦植株以来，转基因技术成为改良小麦品质和其他性状的重要工具，但目前所获得的转基因小麦仅限于Bobwhite等几个基因型[2]。禾谷类作物尤其是小麦的组织培养再生植株较困难，但胚较其他组织易培养。小麦幼胚培养力强，被认为是小麦转基因最理想的外植体材料，利用农杆菌介导小麦转基因成功的报道基本以幼胚为主[3]。研究表明，基因型、培养基、幼胚材料是影响小麦幼胚培养植株再生的3个主要影响因素[4]。良好的愈伤组织是转基因改良小麦的前提。有关研究已证明小麦幼胚的培养再生过程往往表现出明显的基因型差异，不同的小麦基因型可以在致密愈伤组织的诱导、分化及分化能力的保持等方面表现出较大差异[5]。此外，小麦幼胚组织培养与胚龄关系密切，较大幼胚获得再生植株比较困难，幼胚较小的操作困难，也不容易获得好的愈伤组织，因此选择适宜的幼胚对获得更好的培养效果十分重要的。在小麦幼胚愈伤组织诱导中，前人更多研究的是不同基因型在相同培养基上，而极少研究不同培养基对愈伤组织的影响，也没有一个完善的诱导愈伤组织培养基[6]。在基因转化和再生植株研究中，幼胚愈伤组织的诱导率和质量是直接影响转化和再生植株的获得[7]。本研究利用小麦幼胚为材料，利用4种不同培养基类型，采取3种幼胚处理方式，对2种小麦幼胚材料进行愈伤组织诱导，以期筛选适宜的培养基类型和接种方式。

1 材料与方法

1.1 试验材料及处理

供试小麦为新春6号、新春9号，由新疆农业科学院提供，均为新疆地区高产优质早熟的小麦品种，在小麦扬花后3 d田间取幼胚并低温保存。采用整胚接种、切尖接种和破碎接种3种方式进行接种。接种时取整穗中部10个小穗，剥掉颖壳，70%乙醇消毒30 s，25%次氯酸钠溶液消毒15 min，无菌水清洗5遍；处理后的材料放置在培养基中，25 ℃暗培养[8]。愈伤组织诱导率=（产生愈伤组织外植体数/接种的外植体数）×100%。endprint

1.2 培养基

本研究中使用的培养基配方见表1。

1.3 愈伤组织质量的评价

愈伤组织品质的优劣直接影响农杆菌介导转化的效果。研究表明，淡黄色、质地致密、剔透的愈伤组织极适宜遗传转化，评价质量为A级；乳白色、质地较硬、不透明或半透明的愈伤组织较适宜遗传转化，评价质量为B级；白色或褐色硬块状、不透明的愈伤组织不能用于遗传转化，评价为C级[9]。

2 结果与分析

2.1 培养基对小麦幼胚愈伤组织诱导率的影响

新春6号和新春9号小麦品种分别接种在4种不同培养基上进行培养，小麦幼胚的愈伤组织诱导率见表2。幼胚接种于MCIMA+KT培养基上愈伤组织的数量和质量均优于其他3种培养基，为新春6号和新春9号最适宜的培养基。3m1.5和MSD培养基诱导的愈伤组织效果较好。SD2培养基对扬麦87158、安农98005、安农92484基因型小麦幼胚的诱导率和愈伤组织的质量以及再生植株的能力是最好的培养基[10]，本试验中SD2培养基的诱导率为0.002%和0.59%，不适合小麦遗传转化的，这与前人的研究结果并不相同。

2.2 小麦幼胚愈伤组织质量分析

为了确定最适合小麦幼胚愈伤组织分化的培养基，本研究将两个品种同时接种于相同培养基上。同一个品种在不同培养基中愈伤组织的质量均有明显差异，而在同一个培养基中则无明显差异。从图1中可以看出，MCIMA+KT诱导出的愈伤是淡黄色透明状、团块较大、质地致密，是遗传转化最适合的愈伤组织，愈伤组织的质量为A级（表3）；其次为3m1.5和MSD培养基，诱导出的愈伤组织呈乳白色，团块质地较硬，不易被农杆菌侵染，愈伤组织为B级；而在SD2培养基中，接种的受体材料易发生褐变，在本试验中未能诱导出适用于遗传转化的愈伤，愈伤组织质量为C级。

2.3 不同处理方式对幼胚愈伤诱导的影响

在愈伤组织诱导接种时，不同处理方式也会影响愈伤组织的分化率及质量。本研究采取破碎法、切尖法和整胚法3种方法对两种小麦品种的幼胚进行处理，将处理的幼胚均接种到愈伤组织诱导培养基MCIMA+KT上。破碎法处理获得的愈伤组织生长较快，愈伤组织较大，颜色呈淡黄色，质地致密；切尖法处理获得的愈伤组织颜色为乳白色，质地紧密；整胚接种法处理获得愈伤组织的数量和质量都较差，部分幼胚未被诱导出愈伤组织，发生褐变（图2）。前人的研究表明[11，12]，破碎法处理后的幼胚受到创伤刺激后，伤口表面活动会激烈，更容易生成质量较好的愈伤组织，这类愈伤组织呈现淡黄色，松软，适合进行遗传转化，这与本研究结果一致。

3 小结与讨论

基因型、培养基类型、幼胚材料是影响小麦幼胚愈伤诱导的因素，筛选适宜于小麦幼胚培养的培养基和基因型可提高和改良组织培养技术并应用于小麦转基因工程上[13]。本试验将2种基因型的小麦幼胚培养在4种培养基上，发现2种基因型之间出愈情况没有明显差异，诱导出愈伤组织的时间和质量均相差不大。对于同一种小麦品种而言，选用4种培养基进行幼胚愈伤组织诱导，诱导率和质量均有很大差别，依次为MCIMA+KT、3m1.5、MSD、SD2。

选择合适的取材时间，收集最适宜的幼胚材料是直接影响到整个试验的最主要因素之一[14]。在小麦组织培养中发现，体积较小的幼胚比体积较大的幼胚具有更强的再生潜力[15]。通过试验发现，幼胚的田间取材最适合的时间是扬花后3～4 d，幼胚大小为0.7～1.0 mm，此时形成愈伤能力最强；而取材后的幼胚要在72 h内进行愈伤组织诱导。愈伤组织诱导前对幼胚的处理和接种方式也会影响对愈伤组织的诱导效果，本试验对比研究了整胚法，切尖法和破碎法3种处理方法，结果表明，破碎法处理幼胚接种诱导出的愈伤质地紧密，淡黄色透明状，适宜进行遗传转化。

参考文献：

[1] 石珍源，殷桂香，杜丽璞，等.小麦大龄幼胚再生性能改进与农杆菌转化[J].中国农业科学，2011，44（2）：225-232.

[2] 朱晋云，许玉娟，杨丽萍，等.小麦组织培养再生系统及农杆菌介导的转基因技术研究[J].植物遗传资源学报，2008，9（1）：84-89.

[3] 李明浩，陈 玮，邢莉萍，等.农杆菌介导小麦遗传转化条件的优化[J].分子植物育种，2010，8（2）：388-392.

[4] 王廷璞，陈 荃，崔爱明，等.小麦愈伤组织诱导及其植株再生研究进展[J].天水师范学院学报，2008，28（2）：44-48.

[5] 郭祖宝，李学红，杜连彩，等.影响小麦愈伤组织发生因素的研究[J].现代农业科技，2007（19）：129-130.

[6] 丁莉萍，何光源.小麦成熟胚高频植株再生系统的建立[J].植物生理学通讯，2004，40（2）：187-190.

[7] 林 毅，高俊山，李 艳.不同培养基对小麦幼胚再生能力的影响[J].安徽农业大学学报，2003，30（1）：6-9.

[8] 丁莉萍，陈 泠，李圣纯，等.根癌农杆菌介导小麦成熟胚遗传转化影响因素的研究[J].麦类作物学报，2007，27（5）：761-766.

[9] 马兰兰，邓西平，杨淑慎，等.小麦成熟胚愈伤组织的诱导及分化[J].西北农业学报，2011，20（8）：62- 65.

[10] 余桂荣，尹 钧，郭天财，等.小麦幼胚培养基因型的筛选[J]. 麦类作物学报，2003，23（2）：14-18.

[11] 王艳丽，叶兴国，刘艳鹏，等.农杆菌敏感小麦基因型的筛选研究[J].麦类作物学报，2006，25（6）：6-10.

[12] 彭朝华，毛炎麟.小麦成熟胚愈伤组织的诱导和植株再生[J]. 北京农业大学学报，1989，15（4）：397-402.

[13] 肖兴国，张爱民，聂秀玲.转基因小麦的研究进展与展望[J].农业生物技术学报，2000，8（2）：111-116.

[14] 陈梁鸿，王新望，刘广田，等.小麦编码高分子量谷蛋白亚基基因的转化[J].作物学报，1999，25（4）：437-440.

[15] 安海龙，卫志明，黄健秋.小麦幼胚培养高效成株系统的建立[J].植物生理学报，2000，26（6）：532-538.

（责任编辑 屠 晶）endprint

1.2 培养基

本研究中使用的培养基配方见表1。

1.3 愈伤组织质量的评价

愈伤组织品质的优劣直接影响农杆菌介导转化的效果。研究表明，淡黄色、质地致密、剔透的愈伤组织极适宜遗传转化，评价质量为A级；乳白色、质地较硬、不透明或半透明的愈伤组织较适宜遗传转化，评价质量为B级；白色或褐色硬块状、不透明的愈伤组织不能用于遗传转化，评价为C级[9]。

2 结果与分析

2.1 培养基对小麦幼胚愈伤组织诱导率的影响

新春6号和新春9号小麦品种分别接种在4种不同培养基上进行培养，小麦幼胚的愈伤组织诱导率见表2。幼胚接种于MCIMA+KT培养基上愈伤组织的数量和质量均优于其他3种培养基，为新春6号和新春9号最适宜的培养基。3m1.5和MSD培养基诱导的愈伤组织效果较好。SD2培养基对扬麦87158、安农98005、安农92484基因型小麦幼胚的诱导率和愈伤组织的质量以及再生植株的能力是最好的培养基[10]，本试验中SD2培养基的诱导率为0.002%和0.59%，不适合小麦遗传转化的，这与前人的研究结果并不相同。

2.2 小麦幼胚愈伤组织质量分析

为了确定最适合小麦幼胚愈伤组织分化的培养基，本研究将两个品种同时接种于相同培养基上。同一个品种在不同培养基中愈伤组织的质量均有明显差异，而在同一个培养基中则无明显差异。从图1中可以看出，MCIMA+KT诱导出的愈伤是淡黄色透明状、团块较大、质地致密，是遗传转化最适合的愈伤组织，愈伤组织的质量为A级（表3）；其次为3m1.5和MSD培养基，诱导出的愈伤组织呈乳白色，团块质地较硬，不易被农杆菌侵染，愈伤组织为B级；而在SD2培养基中，接种的受体材料易发生褐变，在本试验中未能诱导出适用于遗传转化的愈伤，愈伤组织质量为C级。

2.3 不同处理方式对幼胚愈伤诱导的影响

在愈伤组织诱导接种时，不同处理方式也会影响愈伤组织的分化率及质量。本研究采取破碎法、切尖法和整胚法3种方法对两种小麦品种的幼胚进行处理，将处理的幼胚均接种到愈伤组织诱导培养基MCIMA+KT上。破碎法处理获得的愈伤组织生长较快，愈伤组织较大，颜色呈淡黄色，质地致密；切尖法处理获得的愈伤组织颜色为乳白色，质地紧密；整胚接种法处理获得愈伤组织的数量和质量都较差，部分幼胚未被诱导出愈伤组织，发生褐变（图2）。前人的研究表明[11，12]，破碎法处理后的幼胚受到创伤刺激后，伤口表面活动会激烈，更容易生成质量较好的愈伤组织，这类愈伤组织呈现淡黄色，松软，适合进行遗传转化，这与本研究结果一致。

3 小结与讨论

基因型、培养基类型、幼胚材料是影响小麦幼胚愈伤诱导的因素，筛选适宜于小麦幼胚培养的培养基和基因型可提高和改良组织培养技术并应用于小麦转基因工程上[13]。本试验将2种基因型的小麦幼胚培养在4种培养基上，发现2种基因型之间出愈情况没有明显差异，诱导出愈伤组织的时间和质量均相差不大。对于同一种小麦品种而言，选用4种培养基进行幼胚愈伤组织诱导，诱导率和质量均有很大差别，依次为MCIMA+KT、3m1.5、MSD、SD2。

选择合适的取材时间，收集最适宜的幼胚材料是直接影响到整个试验的最主要因素之一[14]。在小麦组织培养中发现，体积较小的幼胚比体积较大的幼胚具有更强的再生潜力[15]。通过试验发现，幼胚的田间取材最适合的时间是扬花后3～4 d，幼胚大小为0.7～1.0 mm，此时形成愈伤能力最强；而取材后的幼胚要在72 h内进行愈伤组织诱导。愈伤组织诱导前对幼胚的处理和接种方式也会影响对愈伤组织的诱导效果，本试验对比研究了整胚法，切尖法和破碎法3种处理方法，结果表明，破碎法处理幼胚接种诱导出的愈伤质地紧密，淡黄色透明状，适宜进行遗传转化。

参考文献：

[1] 石珍源，殷桂香，杜丽璞，等.小麦大龄幼胚再生性能改进与农杆菌转化[J].中国农业科学，2011，44（2）：225-232.

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[3] 李明浩，陈 玮，邢莉萍，等.农杆菌介导小麦遗传转化条件的优化[J].分子植物育种，2010，8（2）：388-392.

[4] 王廷璞，陈 荃，崔爱明，等.小麦愈伤组织诱导及其植株再生研究进展[J].天水师范学院学报，2008，28（2）：44-48.

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[6] 丁莉萍，何光源.小麦成熟胚高频植株再生系统的建立[J].植物生理学通讯，2004，40（2）：187-190.

[7] 林 毅，高俊山，李 艳.不同培养基对小麦幼胚再生能力的影响[J].安徽农业大学学报，2003，30（1）：6-9.

[8] 丁莉萍，陈 泠，李圣纯，等.根癌农杆菌介导小麦成熟胚遗传转化影响因素的研究[J].麦类作物学报，2007，27（5）：761-766.

[9] 马兰兰，邓西平，杨淑慎，等.小麦成熟胚愈伤组织的诱导及分化[J].西北农业学报，2011，20（8）：62- 65.

[10] 余桂荣，尹 钧，郭天财，等.小麦幼胚培养基因型的筛选[J]. 麦类作物学报，2003，23（2）：14-18.

[11] 王艳丽，叶兴国，刘艳鹏，等.农杆菌敏感小麦基因型的筛选研究[J].麦类作物学报，2006，25（6）：6-10.

[12] 彭朝华，毛炎麟.小麦成熟胚愈伤组织的诱导和植株再生[J]. 北京农业大学学报，1989，15（4）：397-402.

[13] 肖兴国，张爱民，聂秀玲.转基因小麦的研究进展与展望[J].农业生物技术学报，2000，8（2）：111-116.

[14] 陈梁鸿，王新望，刘广田，等.小麦编码高分子量谷蛋白亚基基因的转化[J].作物学报，1999，25（4）：437-440.

[15] 安海龙，卫志明，黄健秋.小麦幼胚培养高效成株系统的建立[J].植物生理学报，2000，26（6）：532-538.

（责任编辑 屠 晶）endprint

1.2 培养基

本研究中使用的培养基配方见表1。

1.3 愈伤组织质量的评价

愈伤组织品质的优劣直接影响农杆菌介导转化的效果。研究表明，淡黄色、质地致密、剔透的愈伤组织极适宜遗传转化，评价质量为A级；乳白色、质地较硬、不透明或半透明的愈伤组织较适宜遗传转化，评价质量为B级；白色或褐色硬块状、不透明的愈伤组织不能用于遗传转化，评价为C级[9]。

2 结果与分析

2.1 培养基对小麦幼胚愈伤组织诱导率的影响

新春6号和新春9号小麦品种分别接种在4种不同培养基上进行培养，小麦幼胚的愈伤组织诱导率见表2。幼胚接种于MCIMA+KT培养基上愈伤组织的数量和质量均优于其他3种培养基，为新春6号和新春9号最适宜的培养基。3m1.5和MSD培养基诱导的愈伤组织效果较好。SD2培养基对扬麦87158、安农98005、安农92484基因型小麦幼胚的诱导率和愈伤组织的质量以及再生植株的能力是最好的培养基[10]，本试验中SD2培养基的诱导率为0.002%和0.59%，不适合小麦遗传转化的，这与前人的研究结果并不相同。

2.2 小麦幼胚愈伤组织质量分析

为了确定最适合小麦幼胚愈伤组织分化的培养基，本研究将两个品种同时接种于相同培养基上。同一个品种在不同培养基中愈伤组织的质量均有明显差异，而在同一个培养基中则无明显差异。从图1中可以看出，MCIMA+KT诱导出的愈伤是淡黄色透明状、团块较大、质地致密，是遗传转化最适合的愈伤组织，愈伤组织的质量为A级（表3）；其次为3m1.5和MSD培养基，诱导出的愈伤组织呈乳白色，团块质地较硬，不易被农杆菌侵染，愈伤组织为B级；而在SD2培养基中，接种的受体材料易发生褐变，在本试验中未能诱导出适用于遗传转化的愈伤，愈伤组织质量为C级。

2.3 不同处理方式对幼胚愈伤诱导的影响

在愈伤组织诱导接种时，不同处理方式也会影响愈伤组织的分化率及质量。本研究采取破碎法、切尖法和整胚法3种方法对两种小麦品种的幼胚进行处理，将处理的幼胚均接种到愈伤组织诱导培养基MCIMA+KT上。破碎法处理获得的愈伤组织生长较快，愈伤组织较大，颜色呈淡黄色，质地致密；切尖法处理获得的愈伤组织颜色为乳白色，质地紧密；整胚接种法处理获得愈伤组织的数量和质量都较差，部分幼胚未被诱导出愈伤组织，发生褐变（图2）。前人的研究表明[11，12]，破碎法处理后的幼胚受到创伤刺激后，伤口表面活动会激烈，更容易生成质量较好的愈伤组织，这类愈伤组织呈现淡黄色，松软，适合进行遗传转化，这与本研究结果一致。

3 小结与讨论

基因型、培养基类型、幼胚材料是影响小麦幼胚愈伤诱导的因素，筛选适宜于小麦幼胚培养的培养基和基因型可提高和改良组织培养技术并应用于小麦转基因工程上[13]。本试验将2种基因型的小麦幼胚培养在4种培养基上，发现2种基因型之间出愈情况没有明显差异，诱导出愈伤组织的时间和质量均相差不大。对于同一种小麦品种而言，选用4种培养基进行幼胚愈伤组织诱导，诱导率和质量均有很大差别，依次为MCIMA+KT、3m1.5、MSD、SD2。

选择合适的取材时间，收集最适宜的幼胚材料是直接影响到整个试验的最主要因素之一[14]。在小麦组织培养中发现，体积较小的幼胚比体积较大的幼胚具有更强的再生潜力[15]。通过试验发现，幼胚的田间取材最适合的时间是扬花后3～4 d，幼胚大小为0.7～1.0 mm，此时形成愈伤能力最强；而取材后的幼胚要在72 h内进行愈伤组织诱导。愈伤组织诱导前对幼胚的处理和接种方式也会影响对愈伤组织的诱导效果，本试验对比研究了整胚法，切尖法和破碎法3种处理方法，结果表明，破碎法处理幼胚接种诱导出的愈伤质地紧密，淡黄色透明状，适宜进行遗传转化。

参考文献：

[1] 石珍源，殷桂香，杜丽璞，等.小麦大龄幼胚再生性能改进与农杆菌转化[J].中国农业科学，2011，44（2）：225-232.

[2] 朱晋云，许玉娟，杨丽萍，等.小麦组织培养再生系统及农杆菌介导的转基因技术研究[J].植物遗传资源学报，2008，9（1）：84-89.

[3] 李明浩，陈 玮，邢莉萍，等.农杆菌介导小麦遗传转化条件的优化[J].分子植物育种，2010，8（2）：388-392.

[4] 王廷璞，陈 荃，崔爱明，等.小麦愈伤组织诱导及其植株再生研究进展[J].天水师范学院学报，2008，28（2）：44-48.

[5] 郭祖宝，李学红，杜连彩，等.影响小麦愈伤组织发生因素的研究[J].现代农业科技，2007（19）：129-130.

[6] 丁莉萍，何光源.小麦成熟胚高频植株再生系统的建立[J].植物生理学通讯，2004，40（2）：187-190.

[7] 林 毅，高俊山，李 艳.不同培养基对小麦幼胚再生能力的影响[J].安徽农业大学学报，2003，30（1）：6-9.

[8] 丁莉萍，陈 泠，李圣纯，等.根癌农杆菌介导小麦成熟胚遗传转化影响因素的研究[J].麦类作物学报，2007，27（5）：761-766.

[9] 马兰兰，邓西平，杨淑慎，等.小麦成熟胚愈伤组织的诱导及分化[J].西北农业学报，2011，20（8）：62- 65.

[10] 余桂荣，尹 钧，郭天财，等.小麦幼胚培养基因型的筛选[J]. 麦类作物学报，2003，23（2）：14-18.

[11] 王艳丽，叶兴国，刘艳鹏，等.农杆菌敏感小麦基因型的筛选研究[J].麦类作物学报，2006，25（6）：6-10.

[12] 彭朝华，毛炎麟.小麦成熟胚愈伤组织的诱导和植株再生[J]. 北京农业大学学报，1989，15（4）：397-402.

[13] 肖兴国，张爱民，聂秀玲.转基因小麦的研究进展与展望[J].农业生物技术学报，2000，8（2）：111-116.

[14] 陈梁鸿，王新望，刘广田，等.小麦编码高分子量谷蛋白亚基基因的转化[J].作物学报，1999，25（4）：437-440.

[15] 安海龙，卫志明，黄健秋.小麦幼胚培养高效成株系统的建立[J].植物生理学报，2000，26（6）：532-538.

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