双酶分步水解低值鱼蛋白的研究

摘要：选用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶两种酶对低值鱼蛋白进行分步水解，分析各因素对鱼蛋白水解的影响，以水解度为特征性指标。单因素试验结果表明，先添加中性蛋白酶的水解效果优于先添加木瓜蛋白酶。通过 L9（34）正交试验确定水解的最佳条件为水解时间为6 h，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶量比（g∶g）为3∶1，水解温度为55 ℃，料液比（m/V，g∶mL）为1∶10，水解效果是最好的，在此条件下水解度为35.85%。

关键词：低值鱼蛋白；分步水解；中性蛋白酶；木瓜蛋白酶；水解度

中图分类号：S661.6 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）16-3890-03

Abstract： The neutral protease and the papain were used to hydrolyze the low-price fish protein and study the process condition of enzymatic hydrolysis. The effects of dosage of enzyme， concentration of substrate， temperature of enzymatic hydrolysis， pH value etc were analyzed. The results showed that it was better to add neutral protease at first than to add the papain at first. The optimal conditions were the ratio of the neutral protease and the papain of 5∶1， the time of hydrolysis of 6 h， the concentration of substrate（m/V） of 1∶10， the temperature of enzymolysis of 55 ℃， pH 7.0. Under which， the hydrolysis could be 35.85%.

Key words： the low-price fish protein； step by step hydrolysis； neutral protease； papain； degree of hydrolysis

中国海域辽阔，其面积为陆地面积的1/3，是一个海洋大国。海洋鱼类是一项可持续发展的资源，它是人类生存所需动物蛋白的主要来源[1]。然而随着捕捞强度的增大，海洋渔业资源逐年衰减，海洋捕捞的中低值鱼产量呈上升趋势，占海洋捕捞产量的57%～59%，而这些中低值鱼用于食品加工的仅占30%[2]，表明资源未得到充分利用。因此，研究如何利用低值小杂鱼显得十分必要。目前，世界各国均在研究开发新产品，中国也在积极跟进，研究低值小海鱼用于调味品的生产、生产鱼体分解蛋白以及其他的一些产品，但都未形成规模生产，产量也不大。因此，在低值海洋小杂鱼的综合利用方面，有待进一步研究和开发。本试验利用资源丰富的低值海鱼蛋白，采用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶进行酶解，目的是找出最佳的水解途径，丰富低值海鱼功能食品开发和利用。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜低值海鱼：购于潮州市桥东市场；中性蛋白酶（BR，江西锐阳生物科技有限公司，酶活力5万U/mg）；木瓜蛋白酶（BR，江西锐阳生物科技有限公司，酶活力80万U/mg）；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

SHP501型超级恒温槽（上海恒平科学仪器有限公司）；KDN型调温电热套（常州国华仪器有限公司）；电子天平、半微量凯氏定氮仪（上海精密科学仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程 低值海鱼→蒸熟→研细→鱼泥→称量→加酶水解→灭酶（沸水浴10 min）→冷却→离心10 min收集所有上清液定容测定游离氨态氮。

1.3.2 测定方法 总氮采用凯氏定氮法[3]；氨态氮采用双指示剂甲醛滴定法[4，5]；蛋白质水解度（DH）=

氨态氨/总氮×100%

1.3.3 试验设计[6-10] 以酶添加顺序、两种酶的用量比例、水解温度、料液比和水解时间为影响蛋白质水解的因素，先通过试验考察各单因素对水解度的影响，再设计正交试验L9（34）来确定木瓜蛋白酶和中性蛋白酶水解低值海鱼的最佳条件。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 酶添加顺序和温度对水解效果的影响 为确定两种酶的添加顺序，分别采用水解温度45、50、55、60、65 ℃，在两种酶的总浓度为0.3%、两种酶用量比例（m∶m）为1∶1，料液比（m/V，g∶mL，下同）为1∶10，水解时间为4 h。选取2种酶添加顺序：①中性蛋白酶先水解2 h后，灭酶后加入木瓜蛋白酶；②木瓜蛋白酶先水解2 h，中性蛋白酶后水解。研究酶添加顺序和温度对水解度的影响，结果见图1。由图1 可知，按照①的添加顺序进行的鱼蛋白的水解效果更好，即水解度更高。在50～60 ℃范围内，水解效果较好，当为55 ℃时，两种水解方式的水解度均为最高，这主要是因为在这个温度下酶的活力是最大的，较低温度时酶的活力比较小，而温度太高时由于蛋白质变性使得活性降低。因此，综合考虑选定酶的添加顺序按照①的方法进行，即添加中性蛋白酶先水解2 h，灭酶后再加入木瓜蛋白酶进行水解。

2.1.2 两种酶的用量比对水解效果的影响 按照试验“2.1.1”将两种酶的总浓度定为0.3%，在温度为55 ℃，低值海鱼料液比1∶10，水解时间为4 h，分别在中性蛋白酶与木瓜蛋白酶的用量比例为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、5∶1、4∶1、3∶1、2∶1条件下进行水解反应，通过水解度的具体数值确定两种酶的最佳用量比。结果见图2。由图2可知，中性蛋白酶与木瓜蛋白酶的比例对鱼蛋白的水解度影响很大，水解效果较好时两种酶的比例为5∶1～3∶1，并且当中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的比例为5∶1时，水解效果是最好的，之后随着木瓜蛋白酶比例的增加，水解度反而有所下降，故在中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的分步水解过程中采用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的比例为5∶1比较合适。endprint

2.1.3 料液比对水解效果的影响 采用两种酶的总浓度为0.3%，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的用量比例为5∶1，水解温度为55 ℃，分别以低值海鱼料液比为1∶25、1∶20、1∶15、1∶10、1∶5进行水解4 h，探究不同料液比对水解效果的影响。结果见图3。由图3可知，料液比对木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的水解效果存在一定的影响，在料液比为1∶25到1∶5的过程中，随着低值海鱼量的增加，水解度呈先增大后减少的趋势。当料液比为1∶20时，水解度达到最大，之后随着低值海鱼量的增加，水解度反而有所降低。这可能是由于低值海鱼浓度过高时，水解度受酶的用量的制约，所以低值海鱼料液比为1∶20比较合适。

2.1.4 水解时间对水解效果的影响 在中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的总酶浓度为0.3%，其比例为5∶1，在料液比为1∶20，反应温度55 ℃，水解时间分别为 3、4、5、6、7 h条件下进行水解反应，研究水解时间对水解度的影响，其结果见图4。从图4可以看出，随着水解时间的增加，鱼蛋白的水解度也随着增大，在5～7 h范围内效果较好，在5 h时达到最大值，当水解时间继续增加时，水解度反而略微下降。因此，从经济的角度考虑，水解的最佳作用时间不宜过长，以5 h左右比较合适。

2.2 鱼蛋白双酶分步水解最佳条件的确定

根据单因素试验结果可知，中性蛋白酶与木瓜蛋白酶的用量比例、水解时间、水解温度、料液比均对水解效果有一定的影响。考虑到水解过程是受以上各因素的综合影响，设计L9（34）正交试验以确定其最佳水解条件。试验结果见表1。采用直观分析法对各因素极差R值大小比较可知，各因素对中性蛋白酶与木瓜蛋白酶分步水解效果影响的大小顺序是水解温度、水解时间、料液比、双酶用量比例。中性蛋白酶和木瓜蛋白酶分步水解鱼蛋白的最佳水解条件是水解时间6 h，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的用量比为3∶1，水解温度55 ℃，料液比1∶10，该组合没有出现在正交表里，进行验证性试验结果表明，在该条件下测得水解度为35.85%，大于正交表里的最大值35.14%，说明此正交试验是成功的，结果可靠。

3 结论

中性蛋白酶和木瓜蛋白酶是高效蛋白水解酶， 用于水解鱼肉蛋白可以获得水解度较高的水解液。试验结果表明，在采用两种酶进行分步水解时，按照先添加中性蛋白酶进行水解，后添加木瓜蛋白酶的酶添加顺序进行水解，水解效果优于先添加木瓜蛋白酶后添加中性蛋白酶的顺序。在研究蛋白酶水解鱼蛋白的影响因素中，水解温度是影响双酶分步水解鱼蛋白的主要因素，其次是水解时间、料液比，双酶用量比例对水解度的影响最小。对鱼蛋白的水解进行正交试验，获得中性蛋白酶与木瓜蛋白酶分步水解鱼蛋白的最佳工艺条件为水解时间为6 h，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶用量比例为3∶1，水解温度为55 ℃，料液比为1∶10，水解效果较好，此时水解度为35.85%。

参考文献：

[1]陈清潮.我国海洋鱼类资源面临的问题和出路[J].南海研究与开发，2001，13（1）：45-47.

[2]吴 敏，尹彦洋，罗爱平，等.双酶分步水解牛骨蛋白工艺的优化[J].食品科学，2009，30（20）：233-226.

[3] 涂宗财，陈剑兵，刘 伟，等.水解鱼鳞胶制备小分子多肽的研究[J].食品科学，2005，26（8）：210-212.

[4] GB 5009.6-1985.食品卫生理化检验手册[S].

[5] 陈 晶，熊善柏，李 洁，等.白鳞鱼骨蛋白酶水解工艺研究[J].食品科学，2006，27（11）：326-330.

[6]周燕芳.鲫鱼水解条件的研究[J].食品研究与开发，2008，29（8）：77-79.

[7]顾 林，孙 婧.鲫鱼蛋白水解及其中性蛋白酶水解液抗氧化活性研究[J].食品科学，2008，29（8）：177-180.

[8]陈 晶，刘友明，熊善柏，等.复合蛋白酶与风味蛋白酶分步水解鱼骨蛋白工艺的优化[J].华中农业大学学报，2007，26（5）：704-708.

[9]金 晶，徐志宏，魏振承，等.双酶分步水解制备菜籽蛋白肽[J].食品与生物技术学报，2010，29（1）：50-55.

[10]张根生，何丽莹，岳晓霞，等.风味蛋白酶与复合蛋白酶分步水解脱脂碎肉粉工艺的优化[J].中国调味品，2011，36（1）：17-21.

（责任编辑 龙小玲）endprint

2.1.3 料液比对水解效果的影响 采用两种酶的总浓度为0.3%，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的用量比例为5∶1，水解温度为55 ℃，分别以低值海鱼料液比为1∶25、1∶20、1∶15、1∶10、1∶5进行水解4 h，探究不同料液比对水解效果的影响。结果见图3。由图3可知，料液比对木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的水解效果存在一定的影响，在料液比为1∶25到1∶5的过程中，随着低值海鱼量的增加，水解度呈先增大后减少的趋势。当料液比为1∶20时，水解度达到最大，之后随着低值海鱼量的增加，水解度反而有所降低。这可能是由于低值海鱼浓度过高时，水解度受酶的用量的制约，所以低值海鱼料液比为1∶20比较合适。

2.1.4 水解时间对水解效果的影响 在中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的总酶浓度为0.3%，其比例为5∶1，在料液比为1∶20，反应温度55 ℃，水解时间分别为 3、4、5、6、7 h条件下进行水解反应，研究水解时间对水解度的影响，其结果见图4。从图4可以看出，随着水解时间的增加，鱼蛋白的水解度也随着增大，在5～7 h范围内效果较好，在5 h时达到最大值，当水解时间继续增加时，水解度反而略微下降。因此，从经济的角度考虑，水解的最佳作用时间不宜过长，以5 h左右比较合适。

2.2 鱼蛋白双酶分步水解最佳条件的确定

根据单因素试验结果可知，中性蛋白酶与木瓜蛋白酶的用量比例、水解时间、水解温度、料液比均对水解效果有一定的影响。考虑到水解过程是受以上各因素的综合影响，设计L9（34）正交试验以确定其最佳水解条件。试验结果见表1。采用直观分析法对各因素极差R值大小比较可知，各因素对中性蛋白酶与木瓜蛋白酶分步水解效果影响的大小顺序是水解温度、水解时间、料液比、双酶用量比例。中性蛋白酶和木瓜蛋白酶分步水解鱼蛋白的最佳水解条件是水解时间6 h，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的用量比为3∶1，水解温度55 ℃，料液比1∶10，该组合没有出现在正交表里，进行验证性试验结果表明，在该条件下测得水解度为35.85%，大于正交表里的最大值35.14%，说明此正交试验是成功的，结果可靠。

3 结论

中性蛋白酶和木瓜蛋白酶是高效蛋白水解酶， 用于水解鱼肉蛋白可以获得水解度较高的水解液。试验结果表明，在采用两种酶进行分步水解时，按照先添加中性蛋白酶进行水解，后添加木瓜蛋白酶的酶添加顺序进行水解，水解效果优于先添加木瓜蛋白酶后添加中性蛋白酶的顺序。在研究蛋白酶水解鱼蛋白的影响因素中，水解温度是影响双酶分步水解鱼蛋白的主要因素，其次是水解时间、料液比，双酶用量比例对水解度的影响最小。对鱼蛋白的水解进行正交试验，获得中性蛋白酶与木瓜蛋白酶分步水解鱼蛋白的最佳工艺条件为水解时间为6 h，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶用量比例为3∶1，水解温度为55 ℃，料液比为1∶10，水解效果较好，此时水解度为35.85%。

参考文献：

[1]陈清潮.我国海洋鱼类资源面临的问题和出路[J].南海研究与开发，2001，13（1）：45-47.

[2]吴 敏，尹彦洋，罗爱平，等.双酶分步水解牛骨蛋白工艺的优化[J].食品科学，2009，30（20）：233-226.

[3] 涂宗财，陈剑兵，刘 伟，等.水解鱼鳞胶制备小分子多肽的研究[J].食品科学，2005，26（8）：210-212.

[4] GB 5009.6-1985.食品卫生理化检验手册[S].

[5] 陈 晶，熊善柏，李 洁，等.白鳞鱼骨蛋白酶水解工艺研究[J].食品科学，2006，27（11）：326-330.

[6]周燕芳.鲫鱼水解条件的研究[J].食品研究与开发，2008，29（8）：77-79.

[7]顾 林，孙 婧.鲫鱼蛋白水解及其中性蛋白酶水解液抗氧化活性研究[J].食品科学，2008，29（8）：177-180.

[8]陈 晶，刘友明，熊善柏，等.复合蛋白酶与风味蛋白酶分步水解鱼骨蛋白工艺的优化[J].华中农业大学学报，2007，26（5）：704-708.

[9]金 晶，徐志宏，魏振承，等.双酶分步水解制备菜籽蛋白肽[J].食品与生物技术学报，2010，29（1）：50-55.

[10]张根生，何丽莹，岳晓霞，等.风味蛋白酶与复合蛋白酶分步水解脱脂碎肉粉工艺的优化[J].中国调味品，2011，36（1）：17-21.

（责任编辑 龙小玲）endprint

2.1.3 料液比对水解效果的影响 采用两种酶的总浓度为0.3%，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的用量比例为5∶1，水解温度为55 ℃，分别以低值海鱼料液比为1∶25、1∶20、1∶15、1∶10、1∶5进行水解4 h，探究不同料液比对水解效果的影响。结果见图3。由图3可知，料液比对木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的水解效果存在一定的影响，在料液比为1∶25到1∶5的过程中，随着低值海鱼量的增加，水解度呈先增大后减少的趋势。当料液比为1∶20时，水解度达到最大，之后随着低值海鱼量的增加，水解度反而有所降低。这可能是由于低值海鱼浓度过高时，水解度受酶的用量的制约，所以低值海鱼料液比为1∶20比较合适。

2.1.4 水解时间对水解效果的影响 在中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的总酶浓度为0.3%，其比例为5∶1，在料液比为1∶20，反应温度55 ℃，水解时间分别为 3、4、5、6、7 h条件下进行水解反应，研究水解时间对水解度的影响，其结果见图4。从图4可以看出，随着水解时间的增加，鱼蛋白的水解度也随着增大，在5～7 h范围内效果较好，在5 h时达到最大值，当水解时间继续增加时，水解度反而略微下降。因此，从经济的角度考虑，水解的最佳作用时间不宜过长，以5 h左右比较合适。

2.2 鱼蛋白双酶分步水解最佳条件的确定

根据单因素试验结果可知，中性蛋白酶与木瓜蛋白酶的用量比例、水解时间、水解温度、料液比均对水解效果有一定的影响。考虑到水解过程是受以上各因素的综合影响，设计L9（34）正交试验以确定其最佳水解条件。试验结果见表1。采用直观分析法对各因素极差R值大小比较可知，各因素对中性蛋白酶与木瓜蛋白酶分步水解效果影响的大小顺序是水解温度、水解时间、料液比、双酶用量比例。中性蛋白酶和木瓜蛋白酶分步水解鱼蛋白的最佳水解条件是水解时间6 h，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的用量比为3∶1，水解温度55 ℃，料液比1∶10，该组合没有出现在正交表里，进行验证性试验结果表明，在该条件下测得水解度为35.85%，大于正交表里的最大值35.14%，说明此正交试验是成功的，结果可靠。

3 结论

中性蛋白酶和木瓜蛋白酶是高效蛋白水解酶， 用于水解鱼肉蛋白可以获得水解度较高的水解液。试验结果表明，在采用两种酶进行分步水解时，按照先添加中性蛋白酶进行水解，后添加木瓜蛋白酶的酶添加顺序进行水解，水解效果优于先添加木瓜蛋白酶后添加中性蛋白酶的顺序。在研究蛋白酶水解鱼蛋白的影响因素中，水解温度是影响双酶分步水解鱼蛋白的主要因素，其次是水解时间、料液比，双酶用量比例对水解度的影响最小。对鱼蛋白的水解进行正交试验，获得中性蛋白酶与木瓜蛋白酶分步水解鱼蛋白的最佳工艺条件为水解时间为6 h，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶用量比例为3∶1，水解温度为55 ℃，料液比为1∶10，水解效果较好，此时水解度为35.85%。

参考文献：

[1]陈清潮.我国海洋鱼类资源面临的问题和出路[J].南海研究与开发，2001，13（1）：45-47.

[2]吴 敏，尹彦洋，罗爱平，等.双酶分步水解牛骨蛋白工艺的优化[J].食品科学，2009，30（20）：233-226.

[3] 涂宗财，陈剑兵，刘 伟，等.水解鱼鳞胶制备小分子多肽的研究[J].食品科学，2005，26（8）：210-212.

[4] GB 5009.6-1985.食品卫生理化检验手册[S].

[5] 陈 晶，熊善柏，李 洁，等.白鳞鱼骨蛋白酶水解工艺研究[J].食品科学，2006，27（11）：326-330.

[6]周燕芳.鲫鱼水解条件的研究[J].食品研究与开发，2008，29（8）：77-79.

[7]顾 林，孙 婧.鲫鱼蛋白水解及其中性蛋白酶水解液抗氧化活性研究[J].食品科学，2008，29（8）：177-180.

[8]陈 晶，刘友明，熊善柏，等.复合蛋白酶与风味蛋白酶分步水解鱼骨蛋白工艺的优化[J].华中农业大学学报，2007，26（5）：704-708.

[9]金 晶，徐志宏，魏振承，等.双酶分步水解制备菜籽蛋白肽[J].食品与生物技术学报，2010，29（1）：50-55.

[10]张根生，何丽莹，岳晓霞，等.风味蛋白酶与复合蛋白酶分步水解脱脂碎肉粉工艺的优化[J].中国调味品，2011，36（1）：17-21.

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